结直肠癌(Colorectal cancer，CRC)是严重危害人类健康的一种常见的消化道恶性肿瘤。在美国，结直肠癌的患病人数仅次于皮肤癌和肺癌，居第三位。在我国，近年来结直肠癌的发病率仅次于肺癌、胃癌和肝癌，居常见肿瘤的第四位。近年来，结直肠癌的发病年龄明显提前，发病率和死亡率也明显呈上升趋势。全球每年结直肠癌新发病病例数可达94万，近50万人因结直肠癌死亡。随着医疗技术的发展，对疾病认识的不断深入，结直肠癌术后5年生存率在20世纪以后有了较大的提高，但术后5年生存率在近十年一直在50%~70%之间波动，无淋巴结转移结直肠癌患者，术后五年生存率为90%，而发生淋巴结转移的患者，术后五年生存率仅为65%。因此，早期发现、早期诊断及早期治疗是改善结直肠癌的疗效和预后的关键，对提高患者生存质量、延长患者生命具有非常重要的意义。探寻有效的恶性肿瘤早期诊断方法一直是医学科研工作者努力的目标之一。目前，分子标志物因其对恶性肿瘤的诊断、治疗和预后具有十分重要的作用，日益引起学术界的广泛关注。肿瘤标志物(tumor marker，TM)是肿瘤细胞分泌产生的一种活性物质，大多数为非特异性相关抗原。对肿瘤标志物进行检测，因其操作简单、快捷，且创伤小，易被患者接受，是目前诊断结肠癌的主要辅助检查之一，应用比较广泛。许多学者在肿瘤标志物对诊断结肠癌的价值方面进行了大量研究，许多文献资料表明肿瘤标志物如癌胚抗原、CA72-4、CA19-9、CA125、CA242在结肠癌中表达较高，这些肿瘤标志物的单一或联合监测对筛查结直肠癌均具有一定的临床应用价值，但迄今为止，仍未发现任何一种高敏感性和强特异性的单一的肿瘤标志物，寻找高灵敏度、高特异性的肿瘤标志物来协助诊断结肠癌仍然是医学科研工作者努力的方向之一。蛋白质组是指在特定时间、特定环境及试验条件下基因组所表达的全部蛋白质。在肿瘤发生、发展过程中，可有多个蛋白质表达上调或下调，筛选、鉴定肿瘤标志物对肿瘤的早期诊断、治疗及预后具有重要意义。蛋白质组学技术具有高通量，高效率等优势，可同时检测组织中所有的蛋白质，通过差异蛋白质组学分析，可发现发病早期特异性强及高敏感性的肿瘤标志物，在指导肿瘤的早期诊断、早期治疗和预后的预测方面具有现实意义。本研究应用二维色谱与质谱联用技术鉴定结直肠癌组织与癌旁组织的差异表达蛋白谱，鉴定出的39个差异蛋白中，有19个差异蛋白表达上调，20个差异蛋白表达下调。这与本实验室前期的试验结果一致。这些蛋白有望成为高敏感性、高特异性的结直肠癌肿瘤标志物，但需经进一步临床验证。本实验室将对39个差异蛋白逐一进行临床验证，本研究只对上调表达蛋白核仁磷酸蛋白(nucleophosmin, NPM)进行临床验证。核仁磷酸蛋白(nucleophosmin, NPM)定位于5q35，具有分子伴侣作用。包括3种亚型：NPM1、NPM2和NPM3，其中研究较为深入的是NPM1。NPM是一类能够在胞核和胞浆之间快速穿梭的多功能蛋白，可通过多种信号通路调节细胞增殖和凋亡，参与控制中心体复制、核糖体的生物合成，参与多种肿瘤的发生。近年来，对NPM的研究主要集中在其与血液系统肿瘤的关系，也有文献报道NPM在一些实体肿瘤，如肝癌、胃癌、前列腺癌等肿瘤中高表达，但国内外对NPM在结直肠癌发生、发展及作用机制方面的研究很少，NPM蛋白在细胞内外是否存在特异性受体？发挥作用的信号转导途径是什么？其在肿瘤发生发展中的作用及机制如何？需要进一步研究。因此，我们拟通过分子克隆技术构建NPM1蛋白表达载体，表达纯化的NPM1蛋白，采用传统杂交瘤技术，制备NPM1单克隆抗体，用于组织NPM1蛋白表达水平的检测，肿瘤的诊断，靶向治疗、及其预后的评估等方面的研究，为探讨NPM1基因作为结直肠癌早期诊断、治疗与预后分子靶标的可能性奠定坚实基础。主要研究结果如下：第一部分：应用二维色谱、质谱联用技术对大肠癌与癌旁组织的差异蛋白质组学研究方法：1、临床样本取材：18例DukesB期腺癌患者，癌组织及癌旁组织标本。2、样品总蛋白提取，蛋白浓度分析。3、制备样品蛋白水解多肽混合物。4、二维色谱与质谱联用分析，数据库检索。结果：1、癌组织：质谱数据采集、整理，获得846个蛋白的鉴定资料。2、癌旁组织：质谱数据采集、整理，获得535个蛋白的鉴定资料。3、将癌组织与癌旁组织的蛋白质组进行比对分析，有显著差异蛋白39个，其中癌组织上调表达蛋白19个，下调表达蛋白20个。结论：1、成功应用二维色谱与质谱联用技术完成大肠癌组织及癌旁组织蛋白质组数据鉴定。2、通过数据鉴定、对比分析共得到癌组织与癌旁组织的差异蛋白39个，其中19个蛋白表达上调，20个蛋白表达下调。第二部分：NPM1基因克隆、原核载体构建及融合蛋白表达、纯化方法：GenBank提取、分析基因序列，设计引物，PCR扩增目的基因序列。回收、纯化PCR产物，连接pET28a构建克隆载体，转化DH5细胞，PCR阳性菌株，小量提取质粒，进行序列测定。测序正确的重组表达质粒pET28a::NPM1转化BL21感受态细胞。表达菌株BL21(DE3)(pET28a::NPM1)接种于LB培养基（含有100g/ml Km）中，1mM IPTG，37℃、250rpm诱导4h。SDS-PAGE分析鉴定蛋白Ni柱纯化，SDS-PAGE电泳，目的条带切胶后进行电洗脱，超滤浓缩后，PBS缓冲液4℃透析过夜，分装，-80℃保存备用。结果：1、合成人源NPM1基因，成功构建原核表达质粒pET28a::NPM1，经DNA序列测序，NCBI-Blast比对，结果与目的序列完全一致。2.原核表达质粒pET28a::NPM1转化入表达宿主，诱导、纯化表达产物经SDS-PAGE分析鉴定为目的蛋白。结论：1.成功构建含有人源NPM1基因序列原核表达质粒pET28a::NPM1。2.经IPTG诱导表达、通过Ni柱纯化、电洗脱，超滤浓缩后获得了高纯度的NPM1蛋白。第三部分：NPM1单克隆抗体制备、纯化、鉴定方法：1、弗氏佐剂与纯化的NPM1蛋白混合乳化制备免疫原，免疫小鼠。2、取血清抗体效价达标的小鼠脾细胞，采用经典的细胞融合法与骨髓瘤细胞融合。3、ELISA法测定上清效价，筛选阳性细胞株。4、有限稀释法对筛选的阳性细胞株进行亚克隆，筛选、建株、冻存，抗体亚型检测。5、阳性杂交瘤细胞株腹水制备及腹水抗体效价检测。6、亲和层析法纯化腹水抗体蛋白，获得NPM1单克隆抗体。7、抗体浓度、纯度、效价及IHC检测结果：1、得到1株能够稳定分泌抗人NPM1单克隆抗体的细胞株。2、抗体亚型为IgG1，抗体效价达到1:720000，抗体纯度达95%以上。结论：1、成功获得可以稳定分泌抗人NPM1单克隆抗体的细胞株。2、制备出了抗人NPM1单克隆抗体，并进行了相关鉴定。第四部分：NPM1在结直肠癌中的表达及其与临床病理参数之间的关系方法：1、收集有完整临床病理资料的105例结直肠癌组织作为试验组，92例配对癌旁组织作为对照组，参照改良的Dukes分期以及2002年修订的国际抗癌联盟（UICC）和美国肿瘤联合会（AJCC）提出的TNM分期方法将临床病理资料分组。2、应用免疫组织化学方法检测结直肠癌组织与癌旁组织中NPM1的表达情况，用统计学软件SPSS17.0分析NPM1蛋白的表达与结直肠癌临床病理参数之间的关系。结果：1、鼠抗NPM1单克隆抗体免疫组化染色，在结直肠癌组织及癌旁组织中均可检测到阳性表达。2、与配对癌旁组织比较，结直肠癌组织样本中NPM1蛋白阳性表达率显著升高。3、肿瘤直径≥4.0cm的结直肠癌组织样本，NPM1蛋白阳性表达率高于直径＜4.0cm的结直肠癌组织样本；Dukes分期中，C期和D期的结直肠癌组织NPM1蛋白阳性表达率显著高于A期和B期的结直肠癌组织；结直肠癌TNM分期中，临床Ⅲ期和Ⅳ期的结直肠癌组织NPM1蛋白阳性表达率明显高于临床Ⅰ期和临床Ⅱ期的结直肠癌组织；伴淋巴结转移的结直肠癌组织中NPM1蛋白阳性表达率显著高于无淋巴结转移的结直肠癌组织；伴远处转移的结直肠癌组织中NPM1蛋白阳性表达率显著高于无远处转移的结直肠癌组织。结论：1、NPM1蛋白在结直肠癌组织中表达上调。2、NPM1蛋白表达上调与肿瘤大小、Dukes分期、TNM分期、淋巴结转移、远处转移显著相关。