论文部分内容阅读
受体酪氨酸激酶样孤儿受体1（ROR1）是一组属于受体酪氨酸激酶（RTK）家族的跨膜蛋白,其在胚胎时期的肌肉和骨骼发育中起关键作用,但在大多数正常成熟组织中极少表达。研究发现,ROR1在慢性淋巴细胞白血病、神经母细胞瘤、乳腺癌、肾癌及卵巢癌等多种肿瘤细胞中过表达,可促进肿瘤细胞生长,增强肿瘤细胞侵袭和转移能力。卵巢癌的发病率在女性生殖系统恶性肿瘤中排第三位,仅次于子宫颈癌和子宫体癌,但其死亡率却高居妇科各恶性肿瘤之首。其以发病隐匿、侵袭转移性强、进展迅速、预后差为主要临床特征,临床治疗方案主要以肿瘤细胞减灭术辅以化疗,虽然一定程度上缓解了病情,但毒副作用明显,极易产生耐药且复发率极高。本课题利用基因工程技术,以制备、表达抗ROR1 Fab抗体,并对其生物特性进行探讨,应用体外实验进一步研究该抗体对卵巢癌生物学行为的影响。目的:1.应用基因工程技术制备、表达嵌合性抗ROR1 Fab抗体。2.体外实验探究嵌合性抗ROR1 Fab抗体对卵巢癌生物学行为的影响。方法:1.制备、表达嵌合性抗ROR1 Fab抗体利用单克隆抗体细胞融合技术筛选抗ROR1阳性单克隆细胞,用RNA提取试剂盒提取细胞总RNA,反转录获得单链cDNA。以此为模板,借助PCR技术,扩增抗ROR1 Fab抗体轻重链可变区序列（VL和VH）,后与数据库比对,依据正确的核酸序列重新设计引物,PCR抗体轻重链可变区和恒定区,并将抗体轻链可变区（VL）和轻链恒定区（CL）连接,将重链可变区（VH）和和重链恒定区（CH1）连接,获得轻链（L）和重组重链（Fd）。后利用酶切位点,分别对轻链（L）、重组重链（Fd）及表达载体pETDUET-1进行酶切,收集酶切纯化产物,将轻链（L）、重组重链（Fd）与表达载体pETDUET-1连接,构建重组质粒pETDUET-1-ROR1-cFab。将重组质粒pETDUET-1-ROR1-cFab转入大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达,蛋白纯化系统纯化得到嵌合性抗ROR1 Fab抗体。2.嵌合性抗ROR1 Fab抗体的活性鉴定利用SDS-PAGE和Western blot检测抗ROR1抗体Fab的表达,ELISA和Biacore X100鉴定抗ROR1抗体Fab与ROR1的特异性结合能力及亲和力。3.嵌合性抗ROR1 Fab抗体的体外实验通过Western blot、流式细胞术和免疫荧光检测A2780和Iose386细胞上ROR1蛋白的表达水平。嵌合性抗ROR1Fab抗体作用于A2780和Iose386细胞,利用CCK-8、细胞划痕实验、Transwell迁移、细胞凋亡等实验方法检测、分析嵌合性抗ROR1 Fab抗体对卵巢癌细胞生物学行为的影响。结果:1.成功构建了原核表达质粒pETDUET-1-ROR1-cFab,经测序,未发生基因突变或产生无功能基因。将其转入大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达,蛋白纯化系统纯化得到嵌合性抗ROR1 Fab抗体。2.SDS-PAGE和Western blot结果表明抗ROR1抗体Fab分子量约为27KD,主要在细胞上清中表达。ELISA结果显示抗ROR1抗体Fab与ROR1抗原能特异性结合。Biacore X100检测得抗ROR1抗体Fab与ROR1抗原的亲和常数为3.233×10-8。3.Western blot、流式细胞术和免疫荧光结果显示ROR1在A2780细胞中高表达,Iose386细胞中低表达。CCK-8、细胞划痕实验、Transwell迁移和细胞凋亡结果显示在较高浓度下抗ROR1抗体Fab可抑制A2780细胞的增殖和迁移,并促进其凋亡。结论:本实验成功制备抗ROR1抗体Fab,验证该抗体能特异性结合ROR1,且具有高亲和力。体外实验研究表明抗ROR1抗体Fab作用于高表达ROR1的A2780细胞时,可抑制该细胞的恶性生物学行为。本研究利用单克隆抗体细胞融合技术得到的单克隆抗体可能在卵巢癌的靶向治疗中有潜在价值。