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背景鼻息肉(nasal polyps)是上呼吸道常见疾病,发病率约为1-2%。现有的研究发现鼻息肉的病理生理基础是重度鼻粘膜组织水肿和慢性炎症反应,但其具体机制至今仍未阐明。近年来人们发现细胞内钙离子在免疫细胞的活化、增殖、分泌细胞因子和脱颗粒反应等功能中起关键作用,但是其具体调节机制尚未清楚。经典型瞬时感受器电位(canonical transient receptor potential, TRPC)通道是果蝇TRP蛋白的哺乳动物同系物。TRPC通道能被IP3激活而产生持续的钙内流。研究发现TRPC通道表达于中性粒细胞、嗜酸性细胞和T淋巴细胞等免疫细胞,介导免疫细胞钙库操纵性钙内流机制；而在TRPC6敲基因鼠研究发现TRPC6的缺失减少了由卵清蛋白激发的支气管嗜酸性细胞数量。然而TRPC通道在鼻息肉发生发展中的的作用及分子机制尚未深入研究。因此我们提出如下假说：鼻息肉组织中TRPC通道以TRPC5通道表达增高为主,高表达的TRPC5通道可能通过激活NF-κB信号转导通路增加嗜酸性粒细胞浸润和致炎介质的增加,从而在鼻息肉的发病机制中发挥重要作用。目的1.观察鼻息肉组织中经典型瞬时型感受器电位通道家族表达情况；2.探讨经典型瞬时型感受器电位通道与鼻息肉嗜酸性粒细胞浸润和炎症反应的关系；3.探讨经典型瞬时型感受器电位通道与核转录因子NF-κB的关系。方法1.鼻息肉患者的入选及标本收集：从2011年5月至2011年12月在山东大学齐鲁医院耳鼻咽喉科随机收集行息肉切除术患者58例和接受鼻中隔偏曲矫正术的患者的下鼻甲黏膜35例做正常对照。2.应用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(real time RT-PCR)检测鼻息肉患者组织中经典型瞬时型感受器电位通道mRNA表达水平。3.应用病理组织学和免疫组织化学技术检测鼻息肉组织标本中经典型瞬时型感受器电位通道的分布和嗜酸性粒细胞数量,分析它们之间的关系。4.应用蛋白免疫印迹(Western Blot)技术检测鼻息肉患者组织中经典型瞬时型感受器电位通道的蛋白表达、炎症因子IL-6和核转录因子NF-κB表达,分析他们之间的关系。结果2.1一般临床资料分析鼻息肉患者和鼻中隔偏曲患者在年龄和性别方面无显著性差异(P＞0.05)。2.2TRPC通道mRNA和蛋白表达水平鼻.息肉组织中TRPC5通道mRNA表达水平明显高于正常对照组(P＜0.05),其他成员表达变化不明显。鼻息肉组织TRPC5通道蛋白表达水平明显高于对照组(P＜0.05)。2.3鼻息肉组织中嗜酸性粒细胞数量嗜酸性粒细胞在HE染色成明显的嗜伊红特性,显示为胞浆内呈反光强的鲜红色。鼻息肉组织中嗜酸性粒细胞数量明显高于正常鼻甲粘膜(P＜0.01)。2.4鼻息肉组织IL-6的蛋白表达水平鼻息肉患者IL-6蛋白表达水平明显高于正常鼻甲粘膜(P＜0.05)。免疫组化显示鼻息肉组织中IL-6蛋白阳性产物主要位于细胞浆和细胞间质,阳性区域所占面积也明显增高(P＜0.05)。2.5鼻息肉组织NF-κB的蛋白表达水平Western blot结果显示：鼻息肉组织NF-κB的非活性形式p65表达量与正常鼻甲粘膜无显著差别(P＞0.05),但是NF-κB的活性形式磷酸化水平的p65(p-p65)表达量比正常鼻黏膜显著增高(P＜0.05)。2.6TRPC通道表达量与鼻息肉组织中各项指标的相关分析鼻息肉组织中TRPC5通道表达水平与嗜酸性粒细胞数量、致炎因子IL-6表达量和NF-κB的活性形式p-p65表达量成正相关(P＜0.01)。结论1.鼻息肉组织中TRPC5通道表达增高；2.高表达的TRPC5通道可能通过激活NF-κB信号转导通路增加嗜酸性粒细胞浸润和IL-6的表达,从而在鼻息肉的发病机制中发挥重要作用。背景鼻息肉(nasal polyps)是多种致病因素共同作用的结果,其中以变态反应和鼻粘膜的慢性炎症为其病理生理基础。许多炎症因子、化学介质和趋化因子参与,其中IgE作为主要的介质在嗜酸性粒细胞激活和脱颗粒过程中起关键性作用。本研究第一部分研究发现：鼻息肉组织中TRPC通道以TRPC5通道表达增高为主,高表达的TRPC5通道可影响鼻息肉中嗜酸性粒细胞浸润和IL-6,也可影响核转录因子NF-κB的活性,但是对于其在鼻息肉中的作用机制尚不明确。有研究发现鼻息肉患者外周血和鼻息肉组织中IgE水平增高,IgE可以刺激鼻息肉组织产生更多的组胺、白三烯类、PGD2等早期反应介质,导致鼻黏膜水肿和慢性炎症反应。也有研究发现IgE可以调节多种离子通道和细胞内钙离子浓度。最近TRPC5通道可以稳定表达于HEK293细胞,为研究TRPC5通道的功能调控机制提供了简单可行的手段。因此我们推测鼻息肉组织中IgE表达增高,高表达IgE引起细胞内钙离子和钙库依赖的钙内流,而TRPC5通道是IgE作用的途径,这为揭示TRPC5通道在鼻息肉中的作用机制提供了新的理论依据。目的1.研究鼻息肉组织中IgE表达改变；2.体外表达系统中TRPC5通道的功能；3.探讨TRPC5通道是否介导了IgE诱导的细胞内钙离子调控。方法1.应用免疫组织化学技术检测鼻息肉组织标本中IgE的表达情况。2.稳定表达TRPC5通道的HEK293细胞系(HEK-TRPC5)的培养：培养条件：DMEM-F12,含10%胎牛血清、50u/ml青霉素和0.5mg/ml链霉素,37℃、5%CO2培养箱中。应用5μig/ml blasticidin和400μg/ml zeocin筛选。由于其携带tetracycline (Te)转录抑制子,需要添加1μg/ml Te刺激24h来诱导TRPC5通道表达。2.钙离子成像：Ca2+荧光标记物Fura-2AM(2uM)37℃孵育1h,固定发射波长510nm,固定激发波长在340nm和380nm作双波长时间扫描,应用TILL Vision软件包采集图像,进行细胞内钙成像,340nm和380nm时荧光信号比值反映了钙离子的浓度。记录不同浓度IgE对稳定表达的TRPC5通道介导的钙离子内流和钙库依赖的钙内流的作用。3.膜片钳电生理记录：室温下,将细胞培养在盖玻片上,置于灌流槽内,应用EPC-10膜片钳放大器和Pulse软件进行刺激脉冲发放和数据记录；采用全细胞膜片钳技术记录TRPC5通道的电流强度的改变及IgE10μg/ml对TRPC5通道电流的作用。结果1.鼻息肉中IgE蛋白表达：与正常粘膜比较,免疫组织化学染色显示鼻息肉中IgE蛋白阳性区域所占面积明显增高(P＜0.01)。2TRPC5通道介导的细胞内钙离子增加：在Te诱导的细胞(Te+),钙离子成像显示TRPC5通道激活剂Gd3+(100μM)可以诱导细胞内钙离子的增加(P＜0.05),这种反应可以被TRPC通道特异阻断剂T5E3Ab (50μg/ml)抑制。3TRPC5通道介导的细胞内钙库依赖性钙内流：在Te诱导的细胞(Te+),首先在无钙外液中用Tg耗竭细胞内钙库,然后将液体换成含2mM Ca2+的标准细胞浴液(复钙),可以引起明显的钙离子内流,这种现象即钙库依赖性钙内流。而在Te未诱导的细胞(Te-),产生小幅度的钙库依赖性钙内流,比Te+细胞明显低。证明这种钙库依赖性钙内流是过表达的TRPC5通道介导的。4.IgE对TRPC5通道介导的细胞内钙离子增加的影响：在Te诱导的细胞(Te+),钙离子成像显示不同浓度IgE(0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml)可以诱导细胞内钙离子的增加(P＜0.05),这种反应可以被TRPC通道特异阻断剂T5E3Ab (50μg/ml)抑制(P＜0.05)。5.IgE对TRPC5通道介导的细胞内钙库依赖性钙内流的影响：在Te诱导的细胞(Te+),Tg耗竭细胞内钙库后再复钙可以引起明显的钙离子内流(P＜0.05)。与未加IgE刺激的细胞比较,10μg/ml IgE预刺激30min的细胞,钙库依赖性钙内流明显增加(P＜0.05)。6.IgE对TRPC5通道电流强度的影响：膜片钳记录显示TRPC5激活剂Gd3+(100μM)可以使稳定表达TRPC5通道的HEK293细胞产生明显的TRPC5通道电流(P＜0.05),10μg/ml IgE也可诱导TRPC5通道电流,TRPC5通道特异性阻断剂T5E3(50μg/ml)可以抑制IgE引起的TRPC5通道电流。结论1.鼻息肉组织中IgE增高；2.增高的IgE可以激活TRPC5通道产生细胞内钙离子增加和增强钙库依赖性钙内流,这可能是TRPC5通道在鼻息肉发生和发展中的作用机制。