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男性不育是引起不孕症的重要因素之一。据2000年世界卫生组织报道，在全世界约8000万对不孕不育夫妇中，男方因素约占40％，女方因素约占50％，男女双方因素约占10％。在我国，根据对河北省10个地区39476对育龄夫妇抽样调查，发现男性不育者占33.15％。导致男子不育的原因非常复杂广泛，涉及生殖系统解剖结构和功能、激素调节、遗传物质、感染免疫等诸多因素的异常和障碍。现阶段对这些因素的研究大多停留在单基因水平和基因组水平。然而，机体真正生理机能的执行者是蛋白质，所以上述分子遗传学研究并不能反映基因转录后的调控、蛋白质表达水平的变化以及蛋白质的翻译后修饰等信息，并且细胞内mRNA水平和蛋白质的表达峰度并不完全一致，因此从蛋白质水平对男性不育机制进行研究显得特别重要。目前对蛋白组学研究多是采用经典的双向电泳技术，通过蛋白质等电点和分子质量的不同而进行分离，这种方法对于分子质量较大、含量较多的蛋白质有很好的分离作用。但不利于小分子质量、微量蛋白质的分离与鉴定。蛋白质芯片-飞行时间质谱技术(Surface Enhanced Laser Desorption／Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry，SELDI-TOF-MS)是1993年后才发展的起来的一项新的蛋白质研究技术，是继基因芯片之后发展起来的生物检验技术，是蛋白芯片与表面加强激光解吸电离飞行质谱的技术组合。它以其高度并行性、高通量、微型化和自动化的特点而很快成为研究蛋白质组学的有力工具。其优越性主要表现在：可直接用未经纯化的样品进行分析；样品需求量少，通常只要数微升；灵敏度高，有利于检出低丰度蛋白；高通量，可以快速发现多个生物标记物，实现自动化分析；有多种不同表面性质的芯片可供选择，有利于发现一些具有特性的蛋白。所以SELDI-TOF-MS在蛋白质组学研究领域是对双向电泳技术的有力补充。受目前常规检测手段的局限，人们未能从整体上系统地分析精浆中的蛋白质群及其作用，因此针对精液异常的男性不育患者，进行精浆的系列比较蛋白组学研究，确立与不育发生相关的重要蛋白质群，揭示关键蛋白的分子作用机制和相互作用网络，是寻找不育原因的一条新思路。本研究旨在利用蛋白质芯片-飞行时间质谱技术(SELDI-TOF-MS)这种新的蛋白组学研究方法，对精液液化延迟、非阻塞性无精症、严重少精症等多种男性不育症患者精浆与正常可生育男性精浆进行检测，比较正常与各不育组之间是否存在差异蛋白，差异蛋白的数量及相应的分子量。弥补常规2D-PAGE蛋白组研究方法对小分子质量、微量蛋白无法检测的缺陷。研究方法本研究中以29例精液标本为研究对象，按WHO《不育标准检查与诊断手册》进行分类：其中精液正常组11例，精液液化延迟组7例，非阻塞性无精组6例，严重少精症(偶见活精)组5例。精液标本离心后分离精浆。应用CM10蛋白芯片捕获蛋白；蛋白质离子化后，用PBSⅡC型蛋白质芯片阅读机对不同组精浆蛋白进行检测，获得各样本的蛋白指纹图谱。应用BioMarker Wizard软件对所测蛋白质进行归一化处理，Ciphergen ProteinChip Software 3.1软件分别对精液液化延迟组与正常组、非阻塞性无精症组与正常组、严重少精症组与正常组、严重少精症组与非阻塞性无精症组进行统计学分析。比较几组间存在的差异蛋白数量、强度。在Swiss-Prot和TrEMBL蛋白质库中对P＜0.01的差异蛋白进行初步筛选。结果1．正常组与液化延迟组正常组与液化延迟组比较，有19个蛋白表达存在差异。其中在液化迟缓组表达较正常组高的蛋白有10个，其分子质量分别为：8696.621 Da，9770.076 Da，9512.309 Da，10202.64 Da，9617.759 Da，10119.41Da，12345.16 Da，12542.41 Da，9407.785 Da，16517.9 Da(P＜0.05)；其中分子质量为8696.621 Da，9770.076 Da，9512.309 Da，10202.64 Da，9617.759 Da的5个蛋白表达增高明显，P＜0.01。在液化迟缓组表达降低的蛋白有9个，其分子质量分别为：2941.903 Da，2669.629 Da，2127.706 Da，2922.53 Da，2688.064 Da，3454.267 Da，3602.682 Da，7596.921 Da，7630.573 Da(P＜0.05)；其中分子质量为2941.903 Da的蛋白质表达明显降低，P＜0.01。蛋白质库查询P＜0.01的几种差异蛋白，提示其中4种蛋白可能是：Zinc finger protein；谷胱甘肽转移酶同功酶；动力蛋白轻链；细胞色素氧化酶多肽。2．正常组与无精组正常组与无精组比较，有28个蛋白表达存在差异。在无精组除分子质量分别为：5423.645 Da，9617.759 Da，10778.81 Da，5379.173 Da的四个蛋白质表达增高外，其余24个差异蛋白质表达均较正常组降低，P＜0.05。其中分子质量分别为7196.058 Da，7630.573 Da，7547.61 Da，7709.833 Da的4个蛋白含量明显下降，有显著性差异，P＜0.01。蛋白质库查询P＜0.01的几种差异蛋白，提示其中1种蛋白可能是：丝氨酸酶抑制因子Kazal型前体。3．正常组与偶见活精组正常组与偶见活精组蛋白表达差异不大，仅有两个低丰度蛋白存在表达差异。均表现为在严重少精组表达降低，其分子质量分别为：2806.517 Da，15313.23Da(P＜0.05)。4．偶见活精组与无精组偶见活精组与无精组相比，有15个蛋白存在表达差异。在无精组表达增高的蛋白有6个，其分子质量分别为：10860.9 Da，5379.173Da，10202.64 Da，10778.81 Da，13788.28 Da，13856.4 Da(P＜0.05)。在无精组表达降低的蛋白有9个，其分子质量分别为：2647.87 Da，7196.058Da，7547.61 Da，5780.493 Da，6393.921 Da，7013.909 Da，7059.844 Da，7409.589Da，8621.5 Da(P＜0.05)。结论1．蛋白质芯片-飞行时间质谱技术可以同时、快速对试验组与对照组之间是否存在差异蛋白进行确定，并可同时检测出多种差异蛋白标志物，是差异蛋白组学研究的较好方法。2．在精液液化过程除了一些研究清楚的较大分子质量的蛋白质参与外，还有众多小分子蛋白参与这一重要的生理过程。其中4种蛋白可能是：Zinc finger protein；谷胱甘肽转移酶同功酶；动力蛋白轻链；细胞色素氧化酶多肽。3．丝氨酸酶抑制因子可能参与精子的发生过程。创新1．首次用SELDI-TOF-MS技术对多种男性不育相关疾病的精浆进行检测。2．首次报道了精液液化延迟患者中还存在大量小分子蛋白质参与这一过程，可能包括Zinc finger protein；谷胱甘肽转移酶同功酶；动力蛋白轻链；细胞色素氧化酶多肽。单纯从分子质量范围看，这些小分子蛋白以往的研究均未涉及。可能是全面阐述精液液化延迟的一个有力补充。3．首次报道了非梗阻性无精患者与正常对照组存在大量差异蛋白表达，其中丝氨酸酶抑制因子可能参与精子生成。4．首次提出与无精症相关的基因均可能有睾丸外靶器官，基因的异常可能会引起其它靶器官蛋白质表达的变化。并使以往需通过分子生物学、病理技术才能诊断的疾病简化为单纯的蛋白质芯片检测成为可能。