论文部分内容阅读
阿托伐他汀是市场上销售量最高的降胆固醇药物。因为药效基团(3R,5S/R)-二羟基己酸酯与HMG-CoA还原酶的底物羟甲基戊二酰具有相似的结构,从而在胆固醇过程中发挥类竞争性抑制剂的作用。阿托伐他汀合成的关键手性中间体6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯需要高光学纯度,生物催化法因其具有良好的立体选择性在6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯合成路线重构中具有重要的工业应用潜力。论文建立了筛选羰基还原酶菌株的快速筛选模型。模型基于2,4-二硝基苯肼对(R)6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯中羰基的颜色反应,通过测定底物的羰基消耗量来间接反映羰基还原酶的活性,并通过HPLC进一步测定菌株的对(R)6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的活性与选择性。运用该筛选模型成功筛选得到60余株能够按照Anti-prelog 规则不对称还原(R-6-氰基-5-羰基-3-羰基己酸叔丁酯的菌株,挑选活性选择性俱佳的ZJB-09225进一步研究。通过形态学观察、生理生化鉴定、18SrDNA序列及系统发育树分析,最终鉴定菌株ZJB-09225为Pichia caribbic 并保藏于 CCTCC,保藏号 CCTCCM 2012411。采用单因素实验设计优化了 P.caribbicZJB-09225的产酶培养条件。获得最佳培养基组成:麦芽浸粉30.0 g/L,葡萄糖20.0 g/L,(NH4)2HPO41.0 g/L,K2HPO4-3H20 2.28g/L,NaCl1.0g/L,CuSO43.0 mg/L;pH7.5。进一步优化了P.caribbic ZJB-09225发酵条件,获得优选的发酵条件:在种龄15 h时以3%(v/v)接种量接入到100.0 mL液体培养基中,30℃培养32h。体积酶活从优化前的4.70U/L达到了 7.17U/L。在使用静息细胞催化制备6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯时,对反应过程中各项催化参数进行了优化,最佳反应体系为:缓冲液K2HPO4-KH2P04(50.0mM),pH7.5,5.0 g/L葡萄糖酸钠,(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯浓度14.0 g/L,静息细胞25.0 g DCW/L,反应温度35℃,。使用磁力搅拌的大体系催化50.0 g/L高浓度6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯时,催化12h后,产物6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯得率可达19.4%,d.e.值94.3%。此外,实验发现中心红和表面活性剂SDS对菌株的活性有明显的提升,添加0.4‰中性红的实验组酶促反应初速度提高到124%,添加1%SDS的实验组酶促反应速率提高到154%。在构建两相反应体系对(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯进行催化时,选择了对二甲苯/水(1:1,v/v)的体系,在该体系中初反应速率是纯水相的238%,10h停止反应时6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯累计浓度达到10.53 g/L,是纯水相反应的135%。