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目的:探讨沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)CT849蛋白在感染细胞中的亚细胞定位;研究CT849蛋白在HeLa细胞中可能的互作蛋白,为进一步了解Ct致病情况提供更多的、可靠的数据支持。方法:采用离心辅助感染的方法,用Ct血清型E感染单层HeLa细胞,分别在感染后6、30、42h用4%多聚甲醛固定,经0.3%Triton-X100透膜后,用含10%FBS的高糖培养基封闭,经一抗孵育、二抗孵育后封片,于荧光显微镜下分别观察细胞核、Ct包涵体、CT849蛋白,分析CT849蛋白的亚细胞定位。取适量生长状态佳的HeLa细胞,Trizol法提取其总RNA,分离mRNA后,反转录成为cDNA。分别用BP酶、LR酶通过Getway同源重组法构建HeLa细胞初级cDNA和次级cDNA文库,按1:1000比例稀释初级文库和次级文库菌液,涂布于LB平板,分别挑选24个阳性克隆进行PCR扩增,鉴定初级文库和次级文库库容量、重组率和插入片段长度。将符合标准的次级文库质粒转化Y187酵母形成HeLa细胞cDNA文库。PCR扩增ct849目的基因,构建pET28a-ct849重组质粒,测序鉴定其基因序列;构建pGBKT7-ct849诱饵载体,将诱饵载体转化Y2Hgold酵母,同时对诱饵载体进行自激活和毒性测定,将没有毒性和自激活现象的诱饵重组质粒阳性菌株和HeLa细胞cDNA文库进行结合生长以作文库筛选和优化,对阳性克隆进行测序和BLAST比对分析得到可能与目的蛋白CT849互作的蛋白。最后,对筛选出的疑似互作蛋白作生物信息学分析。结果:1.在感染后6h、30h、42h 3个时间点中,经荧光显微镜观察,CT849蛋白表达量在沙眼衣原体感染后第30h时最多,在感染细胞的细胞质中可见CT849蛋白信号。2.初级文库菌液涂布的LB平板上长出211个阳性菌落,根据库容量计算公式得初级文库库容量总克隆数为8.4×10~6cfu。在LB平板上随机挑取24个克隆进行菌液PCR鉴定,凝胶电泳结果显示片断长度大小不一,均在1Kbp以上,重组率>90%,符合初级文库质量标准;次级文库菌液涂布的LB平板上长出399个阳性菌落,根据库容量计算公式得次级文库库容量总克隆数为1.5×10~7cfu。在LB平板上随机挑取24个克隆进行菌液PCR鉴定,凝胶电泳结果显示片断长度大小不一,基本在1Kbp以上,重组率>90%,符合次级文库质量标准。3.对pET28a-ct849重组载体测序后进行BLAST比对,结果显示载体构建成功;构建的诱饵重组质粒pGBKT7-ct849对宿主菌无毒性,不能激活宿主菌报告基因MEL1和His3报告基因的表达,可以用于筛库;4.以诱饵重组质粒阳性菌株和HeLa细胞cDNA文库进行结合生长,镜检可见结合生长的酵母细胞,对结合生长子进行加压筛选和通用引物PCR反应,显示文库插入片段的大小不一,片段大小在500-2000bp范围,说明结合生长子所含猎物质粒所携带基因大小各不相同。经测序分析后确定50个疑似互作蛋白,GO(Gene Ontology)分析中蛋白分类分析显示主要集中在核糖体蛋白、衔接蛋白、能量代谢相关蛋白3个大类。结论:1.沙眼衣原体CT849蛋白定位于Ct感染HeLa细胞的细胞质内,可能为衣原体的一个分泌型蛋白;2.筛选出50个可能与CT849相互作用的蛋白,主要包括核糖体蛋白、衔接蛋白、能量代谢相关蛋白3个大类。