砷是公认的环境致癌物,流行病学研究证明砷对于人肺,肝,肾等器官具有致癌作用。砷的致癌症机制主要有遗传物质修饰、DNA断裂损伤及活性氧生成等。许多研究认为DNA断裂损伤在砷的致癌机制中起到重要作用。本文主要从砷导致的DNA断裂损伤角度研究砷的分子遗传毒性,从而进一步了解砷的致癌机制。国内外对砷导致细胞DNA断裂损伤有较多研究,但对于DNA断裂损伤与信号转导通路之间关系的研究很少,而且具有一定争议。本文对JNK信号转导通路与砷引起的DNA断裂损伤之间的关系进行了探索性研究。由于砷可以引起DNA修复过程的改变,而这一过程与信号通路之间有交叉作用,如DNA双链修复损伤蛋白DNA-PK与JNK信号通路有关系。由此可以推测在砷引起DNA断裂损伤过程中,JNK等信号转导通路有可能起到一定的作用。这一研究可以使我们更全面地认识到砷的遗传毒性机制。另一方面,凋亡的最后阶段可以引起DNA断裂的发生,而外源化学物的处理可以直接引起DNA断裂损伤的出现,所以在研究DNA断裂损伤时应当充分考虑凋亡引起的干扰作用。砷在环境中主要存在形式是3价无机砷化合物,因此我们使用亚砷酸钠（NaAsO₂）来进行模拟研究。本课题主要在偏高浓度NaAsO₂处理下对人胚肺成纤维细胞（HELF）引起的单、双链DNA断裂损伤与JNK信号通路之间的关系做了探索性的研究;并揭示了NaAsO₂对HELF细胞增殖、凋亡的影响,观察了在这一过程中JNK信号通路的激活情况,通过抑制JNK信号分子观察单、双链断裂损伤的变化情况,为进一步理解砷化物引起的细胞遗传毒性,全面了解砷化物对机体的损伤机制提供了有意义的线索。方法一.细胞增殖检测细胞增殖使用CCK-8试剂盒检测,细胞接种到96孔板并处理后,加入10μl WST-8于各孔,37℃温孵1-4h后用分光计检测吸光度值,并按对照为100%计算HELF细胞相对增殖率。二.细胞凋亡检测细胞凋亡检测使用常规的Hoechst染色法检测。处理后的细胞用PBS冲洗并在常温下用乙醇固定10min,用PBS洗三次并加入Hoechst33258在室温下放置5min,在荧光显微镜下观察结果。三.碱性彗星电泳检测DNA断裂损伤HELFF细胞用胰酶消化后与低熔点琼脂糖混合铺于已经有固定的正常熔点琼脂糖胶的玻板上,待琼脂糖胶凝固后置于裂解液中2h,温度保持在4℃。然后在4℃和暗光线下放入电泳液中先进行平衡而后电泳。电泳后玻片用中和液冲洗并用SYBR GreenⅠ染色,在荧光显微镜下观察并拍照。Oliver尾矩用国际上通用的共享软件Casp2.1.2测量。四、Western blotting法检测蛋白及磷酸化蛋白细胞不经血清休克以保持与增殖和凋亡的检测条件一致。用细胞裂解液把细胞裂解。裂解后的蛋白先用10%的丙烯酰胺凝胶分离然后转至硝酸纤维素膜上。膜用脱酯牛奶封闭后先后与一抗、二抗结合,然后经染色曝光。为使各条带蛋白相等,使用β-Actin作为对照。结果一.NaAsO₂对HELF细胞增殖的影响HELF细胞用0、5、10、20和40μmol/L NaAsO₂分别处理12、24 h,用MTT方法检测细胞增殖率。在处理12 h时,仅40μmol/L剂量组细胞增殖率与对照组相比有显著降低（P＜0.05）。在处理24 h时,除5μmol/L剂量组外,细胞增殖率均显著低于对照组（P＜0.05）。结果显示NaAsO₂引起明显的HELF细胞增殖抑制且呈现时间-剂量依赖关系。二.NaAsO₂对HELF细胞凋亡的影响HELF细胞用0、5、10、20和40μmol/L NaAsO₂分别处理12、24 h,用Hoechst染色法检测细胞凋亡率。在处理12 h时,各组细胞凋亡率与对照组相比均无显著差异（P＞0.05）。在处理24 h时,20、40μmol/L组凋亡率均显著高于对照组（P＜0.05）。结果显示NaAsO₂处理12h引起的HELF细胞凋亡变化不明显,而NaAsO₂高浓度长时间可明显引起HELF细胞凋亡,且呈现时间-剂量依赖关系。三.NaAsO₂对HELF细胞的DNA单链断裂损伤的影响HELF细胞用0、5、10、20和40μmol/L NaAsO₂分别处理12、24 h,使用碱性彗星电泳方法检测DNA单链断裂损伤情况。结果显示,12h各剂量组OTM值无显著性变化。NaAsO₂处理24h,OTM值在20、40μmol/L显著升高（P分别＜0.05,＜0.01）。结果显示NaAsO₂处理HELF细胞,随着时间延长和剂量的增加,可明显导致DNA单链断裂损伤。四.NaAsO₂对HELF细胞DNA双链断裂损伤的影响HELF细胞用0、5、10、20和40μmol/LNaAsO₂分别处理6、12、24 h,用western blot检测γ-H2AX蛋白表达水平的方法指示DNA双链断裂损伤。结果显示,HELF细胞γ-H2AX表达水平在处理12、24h时各剂量组均明显高于对照组;而在6h时γ-H2AX没有表达,说明了γ-H2AX的形成与NaAsO₂处理时间有关,NaAsO₂作用6h不能产生双链断裂损伤。结果表明,随着时间延长和剂量的增加,NaAsO₂处理可明显导致DNA双链断裂损伤。五.NaAsO₂对HELF细胞JNK激活的影响HELF细胞用0、5、10、20和40μmol/LNaAsO₂分别处理12、24 h,用western blot检测JNK磷酸化水平。结果显示,NaAsO₂处理HELF细胞12 h,可明显激活JNK;而NaAsO₂处理24 h时,各剂量组均没有观察到JNK的激活。结果显示NaAsO₂处理HELF细胞引起JNK在12 h明显激活。六.JNK抑制对NaAsO₂诱导的HELF细胞凋亡的影响HELF细胞用0、40、40μmol/L NaAsO₂分别处理12、24 h,两个砷处理组中一个提前0.5h加入JNK抑制剂SP600125 20μmol/L处理,作为JNK抑制组。结果显示,在12h,虽然JNK抑制组使凋亡率略微下降,但无论对比砷处理组还是对照组,均无显著差异（P＞0.05）;在24h,砷处理组的凋亡率相对于对照均显著性升高,而JNK抑制组的凋亡率较砷处理组显著降低（P＜0.01）。说明JNK抑制剂SP600125可明显拮抗NaAsO₂处理24 h所致HELF细胞凋亡。七.JNK抑制对NaAsO₂诱导的HELF细胞DNA断裂损伤的影响（一）JNK抑制对NaAsO₂诱导的HELF细胞DNA单链断裂损伤的影响细胞处理同六。在12h时,JNK抑制组和砷处理组OTM值与对照组相比均显著性差异（P＞0.05）。在24h时,JNK抑制组的OTM值明显低于砷处理组（P＜0.05）。结果表明,在24h,抑制JNK信号通路可明显减少NaAsO₂所致的DNA单链断裂损伤。（二）JNK抑制对NaAsO₂诱导的HELF细胞DNA双链断裂损伤的影响细胞处理同六。NaAsO₂处理HELF细胞,JNK激活发生在12h,而处理24h时,JNK未激活。在12h,JNK抑制剂可明显抑制NaAsO₂所致的JNK磷酸化（P＜0.05）,同时,JNK抑制剂可明显抑制NaAsO₂引起的γ-H2AX表达升高（P＜0.05）。结果表明抑制JNK信号通路可明显降低NaAsO₂所致HELF细胞DNA双链断裂损伤。结论短时间（12h）砷暴露可在引起细胞凋亡不明显的情况下,通过激活JNK信号通路引起HELF细胞DNA双链断裂损伤。而进一步的砷暴露（24h）可引起JNK激活消失,并且在高剂量下引起细胞凋亡明显增加。我们的结果为研究砷暴露引起的DNA断裂损伤的分子机制提供了新的线索。