元帅系短枝突变体中特异位点的分离及其功能解析

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苹果易产生芽变,芽变的普遍性和多样性在苹果育种中被广泛应用,苹果短枝变异是芽变的一种,有关其变异机理尚不清楚。近年来,有关逆转座子诱导果树芽变机理的报道越来越多,逆转座子的转座特点已使其成为体细胞突变的重要来源之一。前期研究发现,Ty1-copia类逆转座子atr1涉及苹果短枝变异,基于逆转座子atr1长末端重复序列(LTR)的IRAP和染色体步移技术在元帅系短枝变异品种“华帅1号”、“玫瑰红”、“奥勒冈矮生”、“矮红”发现了一长度为4345bp的特异片段。在此基础上,利用染色体步移技术结合生物信息学方法揭示了上述4个元帅系短枝变异品种特异性的突变位点,分析了“元帅”及其非短枝变异和短枝变异品种中特异性突变位点的结构,并借助异源转化的方法检测了导致元帅系短枝变异的特异片段的功能,为解析苹果短枝变异的机制提供研究基础。  1、利用IPCR、TAIL-PCR等技术进一步分离元帅系短枝变异品种“华帅1号”、“玫瑰红”、“奥勒冈矮生”、“矮红”中4345bp的侧翼序列,最终在“元帅”中分别扩增出长度为6758bp和8329bp的片段,后者与前者相比,主要多出了一长度为1536bp的片段;“华帅1号”、“玫瑰红”和“矮红”中分别获得了长度为8329bp和10504bp的片段,后者比前者多出了2190bp,且2190bp插入在1536bp的第1038bp处;“奥勒冈矮生”中获得了长度分别为6758bp和10504bp的片段,序列分析结果显示后者为2190bp和1536bp的共同插入所致,2190bp位于1536bp的第1038bp处。结构分析结果显示,2190bp和1536bp具有soloLTR的典型特征,二者均为solo LTR。  2、利用PCR技术检测了“元帅”及其非短枝变异品种“红冠”、“红星”、“早红星”和短枝变异品种“华帅1号”、“玫瑰红”、“矮红”、“奥勒冈矮生”、“居家店矮生”中2190bp插入位点的临近结构,结果表明元帅系非短枝变异品种“红冠”、“红星”、“早红星”与“元帅”扩增结果一致,长度为1536bp的solo LTR处是一杂合位点,即一条染色体含有1536bp,另一条染色体不含有1536bp。与“元帅”相比,“华帅1号”、“玫瑰红”、“矮红”、“居家店矮生”的一条染色体含有1536bp,另一条染色体为2190bp和1536bp共同插入在不含有1536bp的染色体相应位置所致,其中,2190bp插入在1536bp的1038bp处。与“元帅”相比,“奥勒冈矮生”一条染色体同“元帅”的不含有1536bp的染色体一致;另一条染色体含有2190bp的插入,插入位点是1536bp的第1038bp处。因此,元帅系短枝变异品种“华帅1号”、“玫瑰红”、“矮红”、“奥勒冈矮生”和“居家店矮生”的短枝变异系长度为2190bp的solo LTR所致。  3、利用发根农杆菌K599转化大豆的方法,检测了转基因大豆茎和根系中2190bp和1536bp的表达活性,结果发现2190bp的正、反义链在转基因株系茎中具有表达活性,而在根系中几乎不表达。  4、利用生物信息学的方法预测了元帅系短枝变异中2190bp插入位点两侧约150kb范围内基因的功能,结果发现其中含有23个功能基因,其中包含多个与生长发育相关的基因,如:酰基辅酶A氧化酶1(ACX1)、乙烯反应转录因子ERF、1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶(ACO)、生长素诱导蛋白基因、乙烯响应蛋白基因、SA UR、MYB、周期蛋白依赖性激酶、CBL互作蛋白激酶等。
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