论文部分内容阅读
姜黄素类似物是一类基于姜黄素结构修饰而合成的化学小分子,因具有抗肿瘤、抗炎、抗增殖等多种生物活性而备受关注。细胞自噬(Autophagy)是真核生物广泛存在的一种自我清除的生命现象,在肿瘤的发生发展中具有重要调节作用,发现新的小分子自噬调节剂以及它们作为抗癌药物的潜在用途有重要意义。基于此,我们使用稳定表达GFP-LC3B的U87细胞初步筛选了一系列预先合成的姜黄素类似物,随后利用Western blot检测自噬相关蛋白LC3B和SQSTM1/p62的表达、透射电子显微镜技术检测自噬小体等方法,发现(3E,5E)-1-甲基-3-(3,4-二甲氧基苯亚甲基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮(CA-5f)和(3E,5E)-1-甲基-3-(4-羟基亚苄基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮(CA-5g)可有效调节细胞自噬。进一步利用自噬不同阶段抑制剂以及串联质粒mRFP-GFP-LC3,鉴定出CA-5f抑制自噬体与溶酶体融合,但不依赖于损伤溶酶体的水解功能,也不影响溶酶体的pH值。细胞存活率实验结果表明在相同的浓度下,CA-5f对非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)A549、H157、H358、H1650等均显示明显的细胞毒性,但对正常细胞,例如人脐静脉血管内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)、人肺上皮细胞(Human bronchial epithelial cell,BEAS-2B)以及肾小管上皮细胞(Human renal tubular epithelial,HK-2)等显示无/低毒性。体内实验表明,小鼠对CA-5f具有良好的耐受性,CA-5f有效抑制A549肺癌异体移植模型的生长。Western blot、免疫荧光和TUNEL(Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling)等实验结果显示,CA-5f在体内能够同样有效的抑制自噬流,诱导肺癌细胞凋亡,不影响组织蛋白酶B(Cathepsin B,CTSB)和D(Cathepsin D,CTSD)的水平,与体外实验结果一致。综上,CA-5f作为新型晚期自噬抑制剂,能够有效抑制NSCLC的生长。此外,我们鉴定出了另一种自噬晚期抑制剂CA-5g,该化学小分子同样通过抑制自噬小体与溶酶体融合阻断自噬流。突触融合蛋白17(Syntaxin 17,STX17)定位于自噬小体上,通过募集突触体相关蛋白29(Synaptosome associated protein 29,SNAP29)和溶酶体上的囊泡相关膜蛋白8(Vesicle-associated membrane protein 8,VAMP8)相互作用促使自噬小体与溶酶体融合。Western blot和免疫荧光检测结果表明CA-5g不影响STX17的表达,但抑制STX17和SNAP29募集到自噬小体,可能是CA-5g作为自噬晚期抑制剂的重要分子机制。综上,我们的研究结果表明CA-5f和CA-5g作为新型晚期自噬抑制剂,通过抑制自噬体-溶酶体融合抑制自噬流,这将为研究自噬体-溶酶体融合以及细胞自噬的分子机制提供有力工具。同时CA-5f作为一个对正常细胞无/低毒,对肿瘤细胞有明显毒性的小分子,可为临床治疗NSCLC提供潜在的药物先导化合物。