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随着海洋资源的开发与利用,海洋药物也蓬勃发展,具有多种生物活性和生理功能的褐藻胶受到人们的重视。褐藻胶经降解获得的寡糖能显著提高生物活性并赋予新的生物活性,用微生物褐藻胶裂解酶裂解褐藻胶是获得具有生理功能褐藻寡糖更好的方法。假交替单胞菌(Pseudoalteromonas elyakovii IAM 14594)产的褐藻胶裂解酶(AlyPEEC)具有较宽的底物特异性,能够裂解褐藻胶的各种组成嵌段,并可能是Laminaria褐斑病的毒力因子。该酶全基因ORF编码398个氨基酸的前体蛋白,包含有三个结构域:信号肽、N-端的前体肽和成熟蛋白区域。此酶在细胞质中合成后分泌,分泌过程中切除信号肽和前体肽形成成熟蛋白,成熟蛋白分子量为32 kDa,分泌到细胞外。为了大量制备该褐藻胶裂解酶用以生产褐藻寡糖,我们首先要研究AlyPEEC在大肠杆菌中表达和加工情况。为了研究需要,本文首先从原始菌株中纯化褐藻裂解酶,用以免疫小鼠制备抗褐藻胶裂解酶多克隆抗体。经间接ELISA方法检测抗体效价为1/128,可以完全特异性地识别褐藻胶裂解酶。本研究成功地将alyPEEC基因及编码成熟蛋白区域的基因序列克隆到阿拉伯糖诱导表达载体pBAD24上,构建重组表达质粒pBAD-ALY和pBAD-csALY,在大肠杆菌TOP10中通过阿拉伯糖诱导表达,结果表明TOP10/pBAD-csALY在诱导表达后没有褐藻胶裂解酶活性,TOP10/pBAD-ALY诱导后表达,且具有活性,酶表达量是原始菌株的7.5倍,并且海水影响其蛋白表达及其活性,添加海水比淡水培养基活性高5.8倍。海水影响活性重组褐藻胶裂解酶的产量,海水的组分MgCl2、NaCl、CaSO4能够提高活性酶的产量。RT-PCR方法检测,海水不影响褐藻胶裂解酶基因的mRNA表达水平,含50%(v/v)海水和不含海水的LB培养基中,褐藻胶裂解酶基因的mRNA表达水平相等。Western bloting方法检测蛋白表达,经凝胶成像系统软件分析表明培养基中添加海水能够促进重组蛋白的表达或者增强蛋白质的稳定性。海水在前体蛋白加工上有重要的影响,添加海水能够促使蛋白前体加工成有活性的成熟蛋白。另外表达的重组蛋白分泌到细胞周质空间及细胞外环境中,而不形成包涵体,从而避免蛋白复性等许多问题。将重组表达载体pBAD-ALY转入大肠杆菌MC4100A(wt)CU164A(SecY缺陷型)和BILKOA(Tat缺陷型)中,通过诱导表达AlyPEEC,研究蛋白的转运与加工过程。研究发现,AlyPEEC在大肠杆菌中通过Sec途径转运,转运到细胞周质和培养基中,在细胞周质中的存在两种分子量的活性蛋白分别是42 kDa和32 kDa。细胞质中仍然存在成熟蛋白,这可能是在跨膜时,蛋白没有完全转运。通过分子筛Sephadex G-75柱和离子交换层析DEAE-Sepharose Fast Flow两步法纯化重组酶。纯化的重组褐藻胶裂解酶最适温度为30℃,是一个热不稳定酶,在30°C时保温10 min后,仍保留80%的相对酶活,而在70°C保温10 min后完全没有酶活。该重组酶最适pH值为7.0,在pH 6.0 ~ pH 7.0之间重组的褐藻胶裂解酶比较稳定,在低于pH 6.0或高于pH 7.0酶活明显下降。Na+、K+、Mg2+、Mn2+、Ca2+和Ba2+是重组褐藻胶裂解酶激活剂,而Zn2+, Ag+和Co2+起到抑制作用。螯合剂EDTA较强地抑制重组褐藻胶裂解酶活性,而螯合剂EGTA和1-10-phenanthroline较温和地抑制重组褐藻胶裂解酶活性,这说明纯化的褐藻胶裂解酶是金属酶(Ramirez-Zavala et al. 2004)。PMSF也微弱地抑制重组褐藻胶裂解酶活性,这说明丝氨酸残基对褐藻胶裂解酶的活性中心是必要的(George and Diwan 1983)。该重组褐藻胶裂解酶能够裂解海藻酸钠、poly M、poly G,具有较宽的底物特异性。裂解产物为四糖到六糖的寡聚糖。