研究背景颅咽管瘤(craniopharyngioma)是一种先天性的组织学上表现为良性但具有侵袭性和侵润性的鞍区上皮性肿瘤,其治疗以手术切除为主,但由于肿瘤周围复杂而重要的解剖关系(如视神经,视交叉,垂体柄,颈内动脉,垂体,丘脑下部等)和肿瘤本身因素(如部位、钙化、范围、粘连等),手术全切除率仅为18-84%,术后严重并发症发生率较高,术后死亡率高达1.7-5.4%。而且术后复发率和远期垂体和视丘下部功能障碍也是困扰神经外科多年的难题。复发性颅咽管瘤的治疗难度则明显增大,不仅手术全切除率明显下降,而且围手术期的死亡率和致残率也明显上升。作为一种良性肿瘤,目前手术治疗的总体结果并不能令人满意。放射治疗,包括普通分次外放疗、立体定向放射外科治疗和肿瘤内放射性同位素间质内放疗,作为单独的或辅助的颅咽管瘤治疗措施,已显示出明显的治疗效果。同时,颅咽管瘤对放射治疗的敏感性也得到广泛的临床证实和学者们的认可。立体定向间质内放疗作为辅助治疗可明显减少手术后肿瘤的复发率和复发时间。但与其它肿瘤一样,颅咽管瘤的放射治疗也存在局限性,如较高的放射性副损伤的发生率限制了放射剂量,而肿瘤对放射治疗敏感性的差异,使肿瘤控制率难以达到令人满意的水平。已有研究表明在许多肿瘤(如肺癌,肝癌、乳腺癌和子宫癌)中血管生成能促进肿瘤的氧合、营养灌注,并清除肿瘤的代谢废物,在肿瘤的生长过程中起到了至关重要的作用,同时也是肿瘤对放射治疗抵抗的一个关键因素。血管生成是内皮细胞增殖刺激和抑制因素之间的一个微妙的平衡结果。血管内皮生长因子(VEGF)是最重要的血管生成诱发因素,其受体(VEGFR)主要在血管内皮细胞中表达,介导内皮细胞分裂并对血管通透性产生影响。VEGF家族成员功能的发挥需要与细胞表面的具有酪氨酸激酶活性的VEGFR的结合来介导,VEGFR分为VEGFR-1和VEGFR-2两种亚型,其中VEGFR-2几乎介导了全部VEGF的细胞功能。研究发现VEGF及其受体在多种恶性脑肿瘤(胶质细胞瘤,血管母细胞瘤和脑膜瘤)中的表达明显强于正常脑组织,进一步实验证实VEGF及其受体的过表达不仅可以导致血管生成,还可激发血管内皮细胞和肿瘤细胞的增殖。已有研究证明,在颅咽管瘤中存在β-catenin介导的VEGF/VEGFR的表达异常,而且在釉质型颅咽管瘤的表达明显高于鳞状乳头型,在复发颅咽管瘤的表达也明显高于原发颅咽管瘤。Xia等研究发现VEGF主要表达于釉质型颅咽管瘤肿瘤细胞巢的细胞质和基质中,而且在复发肿瘤中的表达明显高于原发肿瘤,说明VEGF在肿瘤的侵袭性生长和复发中起到至关重要的作用。Vidal等的研究表明,VEGFR-2的mRNA不仅在间质毛细血管表达,同时也表达于颅咽管瘤上皮成分。这些研究表明VEGFR-2在血管内皮细胞和非血管内皮细胞内均发挥了的重要调节作用。我们在临床工作中发现,颅咽管瘤病人对间质内放疗存在很大的放射敏感差异。已有研究主要集中在VEGF/VEGFR-2与颅咽管瘤复发的研究,而对VEGF/VEGFR-2和颅咽管瘤的放射治疗敏感性的研究却鲜有报道。那么VEGF/VEGFR在颅咽管瘤放射抵抗中起着怎样的作用,其作用机制又是什么,这些问题都需要我们进一步探究。为此,本课题首先通过免疫组织化学方法对不同放射敏感性的颅咽管瘤手术切除标本进行检测,明确VEGF/VEGFR-2在颅咽管瘤中的表达和其与颅咽管瘤放疗敏感性的关系。在此基础上,通过原代细胞培养建立颅咽管瘤细胞系和VEGFR-2过表达的体外实验,进一步研究VEGFR-2的表达在颅咽管瘤放射敏感性中所起的作用,为进一步寻找新的颅咽管瘤治疗靶点奠定理论基础。第一部分VEGF/VEGFR-2的表达与颅咽管瘤放射治疗敏感性的关系目的：探讨复发颅咽管瘤肿瘤组织中血管生长因子及其受体-2(VEGF/VEGFR-2)的表达与32P间质内放疗疗效和放射敏感性的关系。方法：纳入2006年1月至2013年12月在我院接受肿瘤内32P间质内放疗的术后复发颅咽管瘤病人32例。应用免疫组化检测放疗前颅咽管瘤肿瘤标本中的VEGF和VEGFR-2的表达,并结合临床资料和术后随访分析二者与放射治疗疗效和放射敏感性的关系。结果：32例复发颅咽管瘤经32P间质内放疗12个月后,经临床证实为放射敏感者9例和不敏感者23例。VEGF多在肿瘤的胞质内表达,VEGFR-2不仅在毛细胞血管内皮细胞且在肿瘤内皮细胞中表达。VEGF、VEGFR-2在不同放射治疗敏感型肿瘤中的表达,差异具有统计学意义(VEGF:z=-2.194, p=0.028; VEGFR-2:z=-2.382, p=0.017)。其中2例VEGFR-2不表达者为放射敏感型,6例VEGFR-2重度表达者均为放射不敏感型。结论：颅咽管瘤内皮细胞VEGFR-2 的表达与32P间质内放疗疗效及敏感性有关。VEGFR-2低表达甚至不表达颅咽管瘤患者,对32P间质内放疗敏感；而VEGFR-2高表达者,对32P间质内放疗不敏感。第二部分颅咽管瘤细胞的原代培养及鉴定目的：探讨有效的颅咽管瘤细胞系的原代细胞培养方法,并对原代培养的颅咽管瘤细胞的生物特性进行镜下观察和相关检测。方法：用组织块胰酶消化法进行颅咽管瘤原代细胞培养,分别用机械刮除法、差速贴壁法、差速消化法对原代培养的颅咽管瘤细胞进行纯化。倒置显微镜观察细胞生长情况及细胞形态,采用细胞免疫荧光实验鉴定原代培养的颅咽管瘤细胞的纯度和上皮性来源。结果：本研究共进行了颅咽管瘤原代细胞培养10次,培养成功且能够传代培养的有8例,最少传代4代,最长传代12代；将6例生长状态良好的已传代2次的颅咽管瘤细胞进行冻存,复苏后细胞生长形态没有发生太大改变,细胞生长状态良好。颅咽管瘤组织块接种于培养瓶中24小时后可见肿瘤细胞沿着组织块向四周爬出,贴壁生长,可见细胞伸展,呈长梭形细胞状。消化、换液,未贴壁的细胞形态多为圆形,透亮,体积较大。重新贴壁后,釉质上皮型颅咽管瘤细胞呈“铺路石”样排列,透亮且折光性好,细胞体积较大,形状呈多边形,核圆,胞浆丰富。初次接种细胞增殖较快,一般3-5天融合率可达80%以上。初次传代细胞增殖较快,随传代次数增多,细胞分裂增殖能力逐渐减弱,传代间隔时间逐渐延长。同时空泡状细胞逐渐增多,细胞内出现黑色小颗粒,细胞渐渐失去分裂增殖能力,呈老化状态,最终细胞失去活性凋亡。广谱角蛋白(pan-CK)在颅咽管瘤细胞的胞浆中呈阳性表达,证明了颅咽管瘤原代培养细胞在培养过程中仍然维持上皮性肿瘤的特性。结论：用组织块胰酶消化法结合差速消化法在含血清的DMEM/f12培养基中成功建立状态良好的颅咽管瘤有限细胞系。颅咽管瘤细胞呈“铺路石”样排列,透亮且折光性好,细胞体积较大,形状呈多边形,核圆,胞浆丰富。广谱角蛋白(pan-CK)在颅咽管瘤细胞浆中阳性表达,证明了颅咽管瘤原代培养细胞在培养过程中仍然维持上皮来源特性。颅咽管瘤细胞系的建立关键在于肿瘤取材,需要获取足够量的实体肿瘤组织,去除囊变、纤维化和钙化组织。第三部分VEGFR-2过表达对颅咽管瘤细胞生物功能的影响目的：在前期颅咽管瘤有限细胞系建立的基础上,构建VEGFR-2腺病毒载体感染颅咽管瘤细胞,探讨VEGFR-2的表达对颅咽管瘤细胞的增殖和放疗敏感性的影响。方法：采用VEGFR-2重组腺病毒载体转染颅咽管瘤细胞,通过qPCR 和 Western blot分别从mRNA和蛋白水平上验证VEGFR-2基因表达是否成功。用CCK-8实验检测VEGFR-2过表达对颅咽管瘤细胞生长增殖的影响。在不同放射强度的X射线下对Ad-VEGFR-2实验组、阴性对照组和空白组进行照射,进一步验证VEGFR-2的过表达对颅咽管瘤细胞的放射敏感性的影响。结果： (1)荧光显微镜观察转染效率：镜下观察显示转染成功,当MOI为150倍时,24h,48h,72h转染效率分别为：30.54±2.15%、80.45±3.37%、85.87±4.32%,其中转染72h和48h的转染效率显著高于转染24 h(P<0.01),综合考虑后本实验我们选择转染48h的细胞做后续实验研究。(2)转染后继续培养48h,qRT-PCR方法测定转染颅咽管瘤细胞 VEGFR-2的mRNA表达。与空白对照组相比,Ad-GFP组细胞VEGFR-2的mRNA水平无显著变化(P>0.05),VEGFR-2过表达组与Ad-GFP组相比：VEGFR-2的mRNA表达显著升高(P<0.05),表明VEGFR-2腺病毒转染颅咽管瘤细胞及VEGFR-2目的基因过表达成功。(3)转染后继续培养72h, Western Blot方法测定转染成功后VEGFR-2蛋白表达。与空白对照组相比较,Ad-e GFP组的VEGFR-2蛋白表达无显著变化(P>0.05),而与Ad-GFP组相比,Ad-VEGFR-2-GFP组的 VEGFR-2蛋白水平显著升高(P<0.01),进一步说明VEGFR-2腺病毒转染颅咽管瘤细胞及VEGFR-2蛋白过表达成功。(4)VEGFR-2过表达对颅咽管瘤细胞体外增殖的影响本实验采用VEGFR-2腺病毒转染技术,将VEGFR-2目的基因转染颅咽管瘤细胞达到VEGFR-2过表达水平。采用CCK-8方法观察Ad.VEGFR-2转染颅咽管瘤细胞24 h、48h、72h后的生长增殖情况,并绘制细胞生长曲线,结果显示与空白对照组相和Ad-e GFP组相比较,Ad-VEGFR-2-GFP组的颅咽管瘤细胞生长加快。(P=0.0000)。结果表明VEGFR-2过表达有效地促进体外颅咽管瘤细胞的增殖。(5)VEGFR-2过表达对X射线造成颅咽管瘤细胞调亡的影响为了阐明VEGFR-2过表达对颅咽管瘤细胞的放射敏感性的关系,本实验将VEGFR-2腺病毒转染颅咽管瘤细胞,转染24h后接受剂量为2Gy,4Gy,6Gy,8Gy的X射线照射,采用Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞术检测细胞凋亡变化。如图5所示,经不同剂量的X射线照射后,空白组和Ad-VEGFR-2组细胞调亡率分别为 2Gy (15.8%±0.5% vs.19.4%±0.3%),4Gy (21.7%±0.6% vs.15.6% ±0.3%),6Gy (24.4%±0.5% vs.17.5%±0.2%),8Gy (25.6%±0.4% vs.19.2%±0.6%)。Ad-VEGFR-2组比空白组细胞调亡减少,差异具有统计学意义(P<0.05)。以上结果表明,VEGFR-2腺病毒转染后VEGFR-2过表达颅咽管瘤细胞对辐射引起的凋亡减少,VEGFR-2过表达提高了颅咽管瘤细胞的放射抵抗。结论：在本研究中我们先用qPCR检测得了6株培养成功的颅咽管瘤细胞内的内源性VEGFR-2表达,发现6株有限颅咽管瘤细胞系VEGFR-2表达很低。因此,我们利用重组腺病毒安全高效地向颅咽管瘤细胞导入VEGFR-2基因,从而建立了VEGFR-2高表达的颅咽管瘤细胞新模型。VEGFR-2对颅咽管瘤细胞生长的影响研究发现VEGFR-2高表达可明显促进颅咽管瘤细胞的增殖,同时提高了颅咽管瘤细胞对X射线的抵抗作用,从体外实验证实了VEGFR-2的表达与颅咽管瘤细胞的放疗敏感性的关系。