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目的完成对生物活性肽（Bioactive peptides,BAPT）的食用安全性测试;基于动物以及肝脏细胞模型明确生物活性肽通过Hedgehog（Hh）-EMT信号通路改善肝纤维化的作用机制及生物学作用。方法1.BAPT的食用安全性测试:将32只SD大鼠随机分为:空白对照组（NC group）、BAPT低剂量组（LD group）、BAPT中剂量组（MD group）以及BAPT高剂量处理组（HD group）。每组8只,雌雄各半。通过灌胃的方式向每只大鼠每次灌胃1m L不同浓度的BAPT,2次/周,NC组给予等量生理盐水灌胃,整个实验周期持续90天,固定时间记录大鼠的体重及进食量。实验结束后,检测血生化:ALT、AST、TC、TG、LDL及HDL水平;检测炎性因子:IL-10、IL-1β和TNF-α;计算脏器指数;进行组织病理学染色、Masson、PAS以及免疫组织化学染色检查。2.BAPT基于Hh-EMT信号通路改善大鼠肝脏纤维化研究:将24只雄性SD大鼠随机分为:空白对照组（NC group）、纤维化模型组（Model group）及BAPT干预组（BAPT group）,每组8只。Model组及BAPT组的SD大鼠分别给予腹腔注射CCl4与橄榄油的混合液（CCl4:橄榄油=2:3）,注射比例为4m L/kg,NC组给予注射等量的生理盐水,2次/周,药物注射共8周。造模第5周开始,每天向BAPT组以灌胃方式给予BAPT溶液,同时,向Model组及NC组大鼠灌胃等比例的生理盐水,持续4周,实验中每周固定时间记录大鼠体重变化。实验结束后进行取材,检测血生化、炎性因子、氧化应激相关指标;计算脏器指数;进行肝脏组织病理学（HE染色、Masson染色、PAS染色、维多利亚蓝染色、网状纤维染色以及免疫组织化染色）检查;进行RT-q PCR以及Western Blot检测炎性、氧化应激、纤维化、Hh信号通路、EMT及凋亡相关基因与蛋白的表达水平。3.BAPT基于调控Hh-EMT信号通路抑制大鼠肝脏细胞纤维化机制的研究:将肝脏细胞系BRL分为3组:空白对照组（NC group,添加正常细胞培养液处理）、纤维化大鼠肝脏组（Model group,含有2mg/m LCCl4的细胞培养液处理）以及生物活性肽组（BAPT group,在添加2mg/m L CCl4的基础上分别添加不同浓度的BAPT,进行药物浓度筛选）。在培养箱培养24h后通过吉姆萨染色法分析各组细胞的存活率,完成生物活性肽的浓度筛选;检测细胞增殖能力、线粒体活性水平、活性氧水平、氧化应激指标;进行RT-q PCR以及Western Blot实验检测炎性、氧化应激、纤维化、Hh-EMT信号通路及凋亡相关基因、蛋白的表达水平。结果1.安全性评价结果显示,在90天实验周期内,各组大鼠观察结果均无异常,各组大鼠的进食量和体重未产生显著性变化（P＞0.05）。与NC组相比,LD、MD及HD组中ALT、AST、TG、TC、HDL及LDL等血液指标及IL-10、IL-1β和TNF-α的炎性因子表达水平无显著性差异（P＞0.05）。病理学染色检查结果显示大鼠心、肝、脾等脏器均未发生病理性变化,不同实验分组的肾、肝组织中炎性因子（IL-10、IL-1β和TNF-α）表达水平基本一致,无显著性差异（P＞0.05）。2.BAPT基于Hh-EMT信号通路改善大鼠肝脏纤维化研究结果显示,实验开始前各组大鼠状态好,但是造模后发生明显改变,在给予BAPT处理后得到改善。与NC组相比,CCl4处理后,Model组大鼠血清中的ALT、AST、TG、TC和LDL水平显著性增加（P＞0.05）,而HDL含量降低（P＜0.05）。BAPT干预后,因CCl4处理导致的大鼠血清中的ALT、AST、TG、TC及LDL含量的增加得到显著性改善,而HDL含量显著增加（P＜0.05）。与NC组相比,CCl4诱导后Model组血清中的IL-1β及TNF-α的水平显著升高（P＜0.05）,而IL-10水平显著下降（P＜0.05）,与Model组相比,BAPT干预后大鼠血清中IL-1β及TNF-α水平显著降低（P＜0.05）,IL-10水平显著上升（P＜0.05）。Model组中SOD、TAOC以及GSH-px含量均显著低于NC组（P＜0.05）,与此同时,Model组中的MDA水平显著上升,与NC组相比,实验数据存在显著性差异（P＜0.05）。BAPT处理后,与Model组相比,大鼠肝脏组织中的SOD、TAOC以及GSH-px显著上升,而BAPT组中的MDA水平显著降低,差异具有统计学意义（P＜0.05）。HE、Masson、PAS、维多利亚蓝以及网状纤维染色检查显示NC组肝脏细胞形态正常,肝细胞索呈放射状排列,Model组大鼠肝脏细胞排列紊乱,可见大量假小叶形成,汇管区扩大,有炎性细胞浸润,BAPT干预后大鼠的肝损伤有明显的改善。免疫组化染色结果:与NC组相比,Model组肝脏组织中a-SMA、Fibronetin、MMP2、MMP9的表达明显上调（P＜0.05）,BAPT处理后,a-SMA、Fibronetin、MMP2、MMP9的表达水平明显下调（P＜0.05）。RT-q PCR实验结果表明,CCl4处理后,与NC组相比,大鼠肝脏组织中IL-1β、TNF-α、α-SMA、Fibronetin、MMP2、MMP9、Vimentin、Shh、Gli1、SMO及Bax的表达水平显著增加（P＜0.05）,而IL-10、SOD2、Catalase、GPx、E-cadherin、Ptch1及Bcl-2表达水平显著下调（P＜0.05）。BAPT处理后,大鼠肝脏组织中IL-1β、TNF-α、α-SMA、Fibronetin、MMP2、MMP9、Vimentin、Shh、Gli1、SMO及Bax的表达水平均显著低于Model组（P＜0.05）,与此同时,BAPT处理可以导致肝脏组织中的IL-10、SOD2、Catalase、GPx、E-cadherin、Ptch1及Bcl-2表达水平显著上调（P＜0.05）。Western blot实验结果显示与NC组相比,Model组大鼠肝脏组织中Bax、Bak、Caspase-3、Shh、Gli1、SMO、Vimentin、α-SMA及Fibronetin蛋白的表达水平均显著增加（P＜0.05）,而Bcl-xl、Bcl-2、E-cadherin及Ptch1蛋白的表达水平显著下降。BAPT处理后,大鼠肝脏组织中Bax、Bak、Caspase-3、Shh、Gli1、SMO、Vimentin、α-SMA及Fibronetin的表达水平均显著下降,与Model组相比,各组蛋白的表达水平之间均有显著性差异（P＜0.05）,与RT-q PCR实验结果维持一致。3.BAPT基于调控Hh-EMT信号通路抑制大鼠肝脏细胞纤维化机制的研究结果表明40μg/m L及60μg/m L BAPT处理组的细胞存活率之间不存在显著性差异（P＞0.05）。Edu染色结果显示,CCl4的处理显著降低了BRL细胞的增殖能力,与NC组相比,Edu染色强度显著下降（P＜0.05）。BAPT组的Edu染色强度显著高于CCl4处理组（P＜0.05）,进一步证明BAPT处理可以有效地改善纤维化导致的大鼠肝脏细胞增殖能力下降。肝脏细胞线粒体活性荧光强度分析了CCl4处理显著降低了BRL细胞的线粒体活性,线粒体红色荧光探针染色强度较NC组显著下降（P＜0.05）,在BAPT处理后,线粒体红色荧光探针染色强度较CCl4处理组显著增加（P＜0.05）;利用DCFH-DA染色检测分析了BRL细胞中的ROS生成水平,结果表明CCl4处理后,BRL细胞中的ROS水平显著增强,显著高于其他两组（P＜0.05）;与NC组相比,BAPT处理后BRL细胞的ROS生成水平并不存在显著性差异（P＞0.05）,CCl4处理后,BRL细胞中的ALT及AST水平显著增加,与NC组相比均有显著性差异（P＜0.05）,与此同时,与NC组相比,CCl4处理显著抑制了BRL细胞中的SOD、TAOC及GSH-px水平,而CCl4处理后BRL细胞中的MDA水平显著增加,进一步表明CCl4处理可以导致大鼠肝脏细胞氧化应激稳态失衡。BAPT处理后,BRL细胞中的ALT及AST水平与CCl4处理组ALT及AST水平均存在显著性差异,而且BAPT处理组的ALT水平与NC组之间不存在显著性差异（P＞0.05）;RT-q PCR实验结果表明与NC组相比,CCl4处理后BRL细胞中IL-1β、TNF-α、α-SMA、Fibronetin、MMP2、MMP9、Vimentin、Shh、Gli1、SMO及Bax的表达水平显著增加（P＜0.05）,而IL-10、SOD2、Catalase、GPx、E-cadherin、Ptch1及Bcl-2表达水平显著下调（P＜0.05）,BAPT处理后,BRL细胞中IL-1β、TNF-α、α-SMA、Fibronetin、MMP2、MMP9、Vimentin、Shh、Gli1、SMO及Bax的表达水平显著下降,均显著低于CCl4处理组（P＜0.05）。Western blot实验结果表明与NC组相比,CCl4处理后BRL细胞中的Bax、Bak、Caspase-3、Shh、Gli1、SMO、Vimentin、α-SMA及Fibronetin蛋白表达水平均显著增加（P＜0.05）,而Bcl-xl、Bcl-2、E-cadherin及Ptch1蛋白的表达水平显著下降,细胞模型及体内模型的一致性证实CCl4处理可以显著增加大鼠肝脏细胞的纤维化及凋亡水平,BAPT处理后BRL细胞中的Bax、Bak、Caspase-3、Shh、Gli1、SMO、Vimentin、α-SMA及Fibronetin的表达水平显著性下降,与CCl4处理组相比,蛋白表达水平存在显著性差异（p＜0.05）,再次表明生物活性肽改善大鼠肝脏纤维化与Hh-EMT信号通路密切相关。结论1.在实验期内,未观察到服用不同浓度的BAPT对大鼠产生毒性方面的不良作用,且未发现非预期的不良影响。2.腹腔注射CCl4和橄榄油混合液,可成功制备大鼠早期肝硬化模型;BAPT可以有效地改善CCl4诱导的早期肝硬化;BAPT也可以有效抑制早期肝硬化过程中的肝脏炎性细胞浸润、胶原纤维以及弹性纤维等细胞外基质的沉积,从而发挥干预早期肝硬化的作用。3.不同浓度的BAPT有效地改善了CCl4导致的细胞损伤,可以有效地改善CCl4处理导致的大鼠肝脏细胞增殖不足、线粒体功能紊乱及细胞内的氧化应激稳态失衡;体内、体外结果进一步证实BAPT处理可以通过调节Hh-EMT信号通路改善大鼠肝脏纤维化。