论文部分内容阅读
飞蝗（Locusta migratoria）喜食多种农作物,是重要的农业害虫之一。目前,高密度蝗灾的防治仍然依赖于大量化学杀虫剂的施用。杀虫剂的大规模、高频率施用又会带来一系列环境和生态问题,包括昆虫抗药性的产生及农业环境污染等。研究表明,导致害虫抗药性产生的重要机制之一是害虫体内解毒酶解毒能力的增强。细胞色素P450（Cytochrome P450,P450）是昆虫体内重要的解毒酶系之一,由多个基因编码,在昆虫对包括多种化学杀虫剂在内的内源和外源化合物代谢解毒过程中发挥着重要作用。随着飞蝗基因组测序的完成和转录组数据库的积累,越来越多的细胞色素P450基因被克隆。迄今为止,飞蝗中至少已有78个P450基因被克隆并命名,面对如此庞大数目的P450基因,对各个基因功能及其表达调控机制的解析成为P450研究所面临的巨大挑战。课题组前期通过RNAi结合杀虫剂生测实验,发现一些可能参与杀虫剂解毒的P450基因,但鉴于虫体内环境的复杂性和RNAi技术的局限性,从蛋白水平对P450的生化特性和解毒机制的解析具有重要作用。另一方面,P450蛋白表达具有精密复杂的调控机制,以适应多变的环境条件。因此,深入了解其调控机理对揭示P450的诱导机制及害虫抗药性机理具有重要意义。本文主要研究内容如下:1、飞蝗微粒体细胞色素P450蛋白含量及其对底物和化学杀虫剂代谢活性比较对飞蝗5龄若虫4种主要解毒组织器官（中肠、胃盲囊、马氏管和脂肪体）中微粒体细胞色素P450蛋白含量和酶活力进行了比较。结果显示,胃盲囊中微粒体P450蛋白含量最高,其次是中肠和马氏管。脂肪体中微粒体P450含量最低,却表现出较高的芳环羟基化（aromatic hydroxylation）、O-脱烷基化（O-dealkylation）和脱苄基化（O-dearylation）活性。尽管胃盲囊中细胞色素P450蛋白含量最高,但对7种检测底物中的6种都显示出较低的酶活性。此外,中肠、胃盲囊和脂肪体可以显著代谢两种拟除虫菊酯类杀虫剂（溴氰菊酯和氟氨氰菊酯）,然而,对其他4种杀虫剂（马拉硫磷、毒死蜱、西维因和烯虫酯）则没有明显的代谢活性。由此可见,昆虫P450酶活性具有组织器官特异性和底物选择性。此外,研究结果还提示我们,仅根据总微粒体P450蛋白含量预测其酶活性是不全面的;2、重组飞蝗CYP6FD1蛋白对模式底物及杀虫剂的代谢研究通过杆状病毒-昆虫细胞表达系统在Sf9细胞中成功表达飞蝗CYP6FD1（LmCYP6FD1）和细胞色素P450还原酶（LmCPR）。测定了重组蛋白对6种模式底物（Luciferin-H、Luciferin-Me、Luciferin-Be、Luciferin-PFBE、Luciferin-CEE和7-ethoxycoumarin）和4种杀虫剂（溴氰菊酯,毒死蜱、西维因和烯虫酯）的催化活性。结果表明,LmCYP6FD1可以催化7-ethoxycoumarin和Luciferin-Me的脱烷基化反应,但未检测到对其他萤光素底物的活性。此外,重组LmCYP6FD1可有效催化溴氰菊酯氧化为羟基溴氰菊酯,且反应过程具有时间依赖性。3、飞蝗CYP6FE1蛋白重组表达及其杀虫剂代谢功能研究采用杆状病毒表达系统在Sf9细胞中成功表达飞蝗CYP6FE1（LmCYP6FE1）和细胞色素P450还原酶（LmCPR）。测定了重组蛋白对6种模式底物（Luciferin-H、Luciferin-Me、Luciferin-Be、Luciferin-PFBE、Luciferin-CEE和7-ethoxycoumarin）的催化活性。结果表明,重组CYP6FE1对几种模式底物均未出现可检测到的活性。鉴于P450对底物的高度选择性,且重组蛋白具有典型的P450吸收峰,通过HPLC技术检测了重组蛋白对5种杀虫剂（溴氰菊酯、毒死蜱、西维因、烯虫酯和吡虫啉）的代谢,发现重组LmCYP6FE1可以催化吡虫啉代谢,进一步通过质谱技术对代谢产物进行分析,发现重组LmCYP6FE1可以将吡虫啉代谢,转化为羟基吡虫啉。4、飞蝗细胞色素b5分子特性及其在P450介导的氧化反应中的功能研究基于飞蝗录组数据库,通过RT-PCR技术克隆获得飞蝗Cyt-b5（LmCyt-b5）全长cDNA序列,并经测序进行验证。对其氨基酸聚类分析结果表明,LmCyt-b5与蜚蠊目的Cyt-b5聚为一枝。定量分析结果表明,LmCyt-b5在飞蝗卵巢、马氏管、中肠、胃盲囊和脂肪体中高表达。沉默LmCyt-b5表达后,飞蝗对4种杀虫剂的敏感性未出现明显变化。干扰LmCyt-b5或同时干扰LmCyt-b5和LmCPR基因表达后,飞蝗总微粒体蛋白对底物7-ethoxycoumarin（7-EC）的催化活性未出现明显改变。然而,通过Bac-to-Bac杆状病毒表达系统将LmCyt-b5与LmCYP6FD1和LmCPR共表达时,可显著提高重组LmCYP6FD1对底物7-EC的催化活性。研究结果表明,LmCyt-b5在LmCYP6FD1对7-EC的催化反应过程中发挥着一定的作用。5、转录因子CncC对飞蝗杀虫剂解毒相关基因的表达调控研究克隆获得飞蝗CncC（LmCncC）全长cDNA序列,进一步沉默飞蝗CncC基因表达后,结合杀虫剂生物测定实验,发现干扰LmCncC基因表达后,飞蝗对溴氰菊酯和吡虫啉的敏感性增加。为进一步解析CncC通过调控哪些解毒基因表达,从而导致杀虫剂敏感性增加。本文对注射dsCncC和dsGFP的样品进行比较转录组测序,筛选到与解毒相关的9个下调表达基因,包括5个细胞色素P450基因（CYP6FD1、CYP6FD2、CYP6FE1、CYP6HL1和CYP6MU1）和4个UGT（UGT392A1、UGT392A2、UGT392B1和UGT392C1）基因。对上述基因进行测序验证后,通过RNAi结合杀虫剂生测实验,分析其在溴氰菊酯和吡虫啉解毒中的作用。结果发现,沉默LmCYP6FD1和LmUGT392C1基因表达后,飞蝗若虫对溴氰菊酯的敏感性增强;沉默LmCYP6FE1和LmUGT392C1基因表达后,飞蝗对吡虫啉的敏感性增强。由此推测,飞蝗CncC通过调控上述基因的表达,参与溴氰菊酯和吡虫啉的代谢。综上所述,本文首先从蛋白水平对飞蝗主要解毒组织器官中微粒体P450的生化特性进行了系统分析;接着以两个CYP6家族细胞色素P450为代表,借助Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,表达重组P450蛋白,并对其酶活特性和杀虫剂代谢功能进行了系统研究;最后,从解毒基因重要转录调控因子CncC入手,研究了其对杀虫剂的响应及对解毒基因表达的调控作用,本文研究结果将为今后深入开展飞蝗P450基因表达调控机制、蛋白生理生化特性及杀虫剂代谢解毒机理提供理论与实践依据。