缺氧诱导外泌体Hsacirc0048117促进食管鳞癌中巨噬细胞向M2型分化的机制研究

来源 :中国人民解放军海军军医大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:neu20063043
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背景:食管鳞癌的发生发展是多因素作用、多基因变化和多阶段发展的综合过程。其中肿瘤微环境的变化起着重要作用,肿瘤细胞增殖、侵袭迁移等生物学特征依赖于肿瘤微环境所提供的支持,而肿瘤微环境包括各种炎性细胞、免疫细胞、淋巴管、血管等。近年来对于肿瘤微环境的研究逐渐揭示缺氧在各种恶性肿瘤发生发展过程中的重要作用。研究证实在缺氧条件下,多种缺氧反应基因通过多种信号通路,参与了食管鳞癌细胞的增殖、分化、侵袭和转移过程。在非小细胞肺癌、胶质瘤、结直肠癌以及胰腺癌等恶性肿瘤中发现缺氧可以通过促进肿瘤相关巨噬细胞的极化,从而促进恶性肿瘤的发展,但是该机制在食管鳞癌中的相关研究还未见报道。外泌体广泛存在于血液、尿液、唾液、脑脊液和母乳液等多种体液中,其中包含m RNA,micro RNA,lnc RNA,circ RNA,DNA片段和蛋白质等多种物质。肿瘤细胞以外泌体的方式将细胞内部具有特殊功能的非编码RNA以及蛋白分泌至肿瘤微环境中,从而影响肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭和迁移等。环状RNA是由共价键形成的连续闭合环状结构的非编码RNA,因为其没有5’端帽子以及3’端Poly尾,相对于线性RNA,具有更高的稳定性和保守性,广泛存在于真核细胞生物中。环状RNA可以作为竞争性内源性RNA,与特定的miRNA相结合,吸附miRNA发挥miRNA“海绵”的作用。通过高通量的二代测序结合生物信息学分析,已经证实有较多环状RNA参与了食管鳞癌的发生发展,在肿瘤细胞的增殖、分化、侵袭和迁移以及肿瘤微环境的调节方面具有重要作用。研究发现肿瘤细胞外泌体中环状RNA的表达丰度高于细胞本身,所以我们以外泌体中的环状RNA为切入点,筛选出在缺氧微环境中参与肿瘤相关巨噬细胞极化的环状RNA,并结合生物信息学分析其具体生物学功能以及分子机制,为食管鳞癌发生发展的基础研究提供新的理论依据。目的:(一)提取并富集缺氧和常氧条件肿瘤细胞培养基中的外泌体,进行二代测序筛选目的环状RNA并在血清学中进行验证;(二)验证Hsacirc0048117的生物学功能,明确Hsacirc0048117与TLR4可竞争性结合miR-140并评价三者对于巨噬细胞极化的共同作用;(三)探索肿瘤细胞外泌体中Hsacirc0048117对于巨噬细胞极化的作用以及对于食管鳞癌发生发展的影响。方法:(一)外泌体的提取和鉴定1、细胞的处理,培养基和血清的收集:收集缺氧和常氧培养12和24小时的食管鳞癌细胞系Eca-109细胞上清;收集12例食管鳞癌患者和5例健康成人志愿者外周静脉血2ml。2、外泌体的提取和富集:利用外泌体提取试剂盒对细胞培养基和血清按步骤提取和富集外泌体,-80℃保存。3、利用透射电镜、纳米颗粒跟踪系统和外泌体定量试剂盒等对外泌体进行鉴定以及定量分析。(二)外泌体中目的环状RNA的筛选和功能鉴定1、RNA提取、反转录和测序:提取外泌体中总RNA,定量并检测RNA完整性并反转录成双链c DNA,标记环状RNA和芯片杂交,洗脱后扫描得到原始图像。2、数据分析:提取原始数据后进行标准化和后续处理。利用倍数变化值进行差异基因和差异环状RNA筛选,对差异基因进行GO功能富集分析和KEGG信号通路分析并进行非监督层次聚类,利用碱基序列预测micor RNA-target关系对,综合ce RNAscore和表达值预测结果筛选目的环状RNA。3、q RT-PCR对目的环状RNA进行细胞和血清中表达量验证,挑选表达差异最为显著的circ RNA做后续机制研究,Sanger一代测序确认反向插接位点,RNase R耐受性实验验证其环形结构,设计si RNA或者过表达慢病毒,通过一系列细胞表型实验,验证目的环状RNA所发挥的细胞功能。(三)Hsacirc0048117促进巨噬细胞向M2型分化的分子机制1、通过生物信息学分析筛选与Hsacirc0048117结合的miRNA,pull-down检测相应miRNA富集情况并确定miR-140与Hsacirc0048117结合;2、Ago2-RIP:在巨噬细胞中使用Ago2抗体进行RNA免疫沉淀,RIP-q PCR检测Hsacirc0048117是否与AGO2蛋白结合;3、通过设计合成探针对Hsacirc0048117和miR-140进行巨噬细胞内的原位杂交,检测两者在细胞中的定位和表达;4、荧光素酶基因报告实验:构建Hsacirc0048117的突变型和野生型载体,将miR-140的模拟物以及对照与之共转染,检测荧光素酶活性,证实Hsacirc0048117与miR-140之间直接相互作用。5、根据生信分析结果,寻找参与巨噬细胞极化的miR-140潜在靶基因,荧光素酶报告实验确定miR-140下游靶基因TLR4,通过质粒转染,验证Hsacirc0048117和miR-140表达变化对于TLR4表达的影响以及对于巨噬细胞极化的影响。(四)外泌体中Hsacirc0048117对巨噬细胞极化和食管鳞癌生物学行为的影响1、外泌体入胞:利用DIL活细胞示踪剂对外泌体进行荧光染色,观察外泌体进入巨噬细胞的情况;2、将巨噬细胞和缺氧/常氧处理的食管鳞癌细胞分泌的外泌体共培养,流式细胞仪检测各组巨噬细胞的极化情况;3、外泌体中Hsacirc0048117对肿瘤细胞的作用:利用Transwell小室建立肿瘤细胞、巨噬细胞以及外泌体共培养体系,观察各组巨噬细胞对食管鳞癌细胞侵袭和迁移能力的影响;4、收集50位食管鳞癌患者和12位正常健康志愿者的外周血,提取外泌体并检测其中Hsacirc0048117的表达,并分析其与临床病理资料的相关性。结果:(一)外泌体的提取、富集和鉴定透射电镜下观察处理好的样品明显可见囊泡样结构,直径约100nm,纳米颗粒跟踪系统结果表明各组外泌体提取液中颗粒浓度在1-10×1011个/ml之间,所测得颗粒依照大小排列,中位数粒径均在100-120nm之间,这些粒径所占百分比均超过98%。蛋白印迹结果表明样品中外泌体标记物CD63和TSG101蛋白表达明显。以上结果提示外泌体的收集纯度和丰度较高。(二)Hsacirc0048117促进肿瘤相关巨噬细胞向M2型转化测序结果发现缺氧处理后存在显著差异(变化倍数≥2且p<0.05)的环状RNA在12小时处理组中表达上调的有526种,表达下调的有229种,在24小时组有175种上调,276种下调。综合表达水平、MRE数目、ce RNAscore、表达值和p值,选取前5个作为目的环状RNA进行筛选,而后在细胞及血清中进行验证,发现Hsacirc0048117的表达稳定且变化趋势一致,选择其作为研究对象。GO功能富集分析提示Hsacirc0048117可能参与巨噬细胞的极化。利用PMA诱导单核细胞THP-1成功分化为巨噬细胞,过表达Hsacirc0048117后的巨噬细胞表面CD14和CD206表达明显增加,表明Hsacirc0048117促进巨噬细胞向M2型转化。(三)Hsacirc0048117与TLR4竞争性结合miR-140促进巨噬细胞向M2型分化在巨噬细胞中使用AGO2抗体进行RNA免疫沉淀(RIP),Hsacirc0048117被AGO2抗体显著富集,提示Hsacirc0048117具有作为ce RNA的功能。使用Circular RNA Interactome和miRanda miRNA靶预测工具,发现31个可能与Hsacirc0048117结合的miRNA,根据Context score选取前10位miRNA,而后通过circ RIP纯化Hsacirc0048117相关的RNA,发现miR-140有特异性富集,FISH检测显示Hsacirc0048117和miR-140共定位。通过生物素偶联的miR-140模拟物的pull down实验,我们观察到Hsacirc0048117与对照组相比有明显的富集。荧光素酶报告基因实验表明miR-140模拟物与Hsacirc0048117结合后降低了至少50%的荧光素酶报告活性。突变了Hsacirc0048117的靶位点,将相应的miRNA转染到Eca-109细胞后,荧光素酶活性没有明显变化。miR-140和TLR4的荧光素酶报告实验也证实,miR-140可以靶向结合TLR4的3‘-非翻译区并下调其表达。巨噬细胞内过表达Hsacirc0048117可以上调TLR4的表达,而过表达miR-140后TLR4的蛋白表达水平下降。巨噬细胞中干扰Hsacirc0048117的表达,可以抑制其向M2型转化,而当巨噬细胞中miR-140表达被抑制后,M2表型的细胞明显增多。以上实验结果证实Hsacirc0048117和TLR4可以竞争性结合miR-140,互为竞争性内源性RNA,Hsacirc0048117通过靶向吸附miR-140,从而上调miR-140的靶基因TLR4表达,促进巨噬细胞向M2型转化。(四)外泌体中Hsacirc0048117促进巨噬细胞的极化和肿瘤细胞的侵袭和转移通过对外泌体进行荧光染色,观察其进入巨噬细胞的过程。建立巨噬细胞和外泌体共培养体系,结果发现缺氧肿瘤细胞分泌的外泌体和巨噬细胞共培养后可以上调巨噬细胞内Hsacirc0048117和TLR4的表达,从而促进巨噬细胞向M2型转化的作用,而利用si RNA转染肿瘤细胞干扰Hsacirc0048117的表达,缺氧培养后将其分泌的外泌体与巨噬细胞共培养,结果发现M2型巨噬细胞的比例明显下降,提示肿瘤细胞通过外泌体的形式将Hsacirc0048117分泌至细胞外,被巨噬细胞吞噬后,高表达的Hsacirc0048117促进巨噬细胞向M2型分化。建立肿瘤细胞、巨噬细胞以及外泌体的共培养体系,通过Transwell侵袭迁移实验证实,巨噬细胞和缺氧刺激的肿瘤细胞分泌的外泌体共培养后,M2型巨噬细胞可以增强食管鳞癌细胞侵袭和迁移的能力。通过Elisa检测下室培养基中Arg1、IL-10以及TGF-β的表达,发现缺氧肿瘤细胞分泌的外泌体可以促进M2型巨噬细胞分泌Arg1、IL-10以及TGF-β,从而增强肿瘤细胞侵袭和迁移能力。对比肿瘤患者和健康志愿者血清中Hsacirc0048117的表达,发现Hsacirc0048117在肿瘤患者血清外泌体中的表达明显高于正常人,而且外泌体中高表达的Hsacirc0048117与肿瘤的T分期、N分期以及TNM分级明显相关。结论:本研究对于肿瘤微环境、外泌体以及环状RNA在食管鳞癌发生发展过程发挥的作用做了初步的探讨和摸索,我们在缺氧处理后的肿瘤细胞分泌的外泌体中找出了一些差异表达的环状RNA,并进行了临床标本的验证,筛选出Hsacirc0048117作为研究对象,发现外泌体可以携带Hsacirc0048117进入肿瘤相关巨噬细胞并且诱导其向M2型转化的能力,并且通过生物信息学分析和分子生物学实验证实在巨噬细胞内Hsacirc0048117可以作为miR-140“海绵”,和TLR4竞争性结合miR-140,并且高表达Hsacirc0048117的巨噬细胞可以上调细胞内TLR4的表达,促进巨噬细胞向M2型转化,同时还可以刺激巨噬细胞分泌Arg1、IL-10以及TGF-β,增强肿瘤细胞侵袭和迁移能力,促进食管鳞癌细胞发生转移。在食管鳞癌病人外周血中Hsacirc0048117的表达与肿瘤T分期、N分期以及TNM分级相关,该研究也为今后探索外泌体中环状RNA在食管鳞癌中的作用提供一定的理论基础和参考意见。
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