【摘 要】
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暴马桑黄（Sanghuangporus baumii）是一种珍贵的药用真菌,具有抗炎,保肝护肝和抗肿瘤等多种功效,其中三萜类物质是暴马桑黄主要的药用成分之一,但暴马桑黄中三萜含量无法满足市场需求,影响了其在医疗保健中的应用,因此如何提高三萜含量则成为暴马桑黄研究的关键。水杨酸是一种次生代谢物诱导剂,本研究将水杨酸添加到暴马桑黄液体发酵培养体系中,以三萜含量为指标筛选出最适的水杨酸添加浓度和处理时间
【基金项目】
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博士研究生自主创新项目（2572020AW18）；
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暴马桑黄（Sanghuangporus baumii）是一种珍贵的药用真菌,具有抗炎,保肝护肝和抗肿瘤等多种功效,其中三萜类物质是暴马桑黄主要的药用成分之一,但暴马桑黄中三萜含量无法满足市场需求,影响了其在医疗保健中的应用,因此如何提高三萜含量则成为暴马桑黄研究的关键。水杨酸是一种次生代谢物诱导剂,本研究将水杨酸添加到暴马桑黄液体发酵培养体系中,以三萜含量为指标筛选出最适的水杨酸添加浓度和处理时间。为进一步了解水杨酸对暴马桑黄三萜合成的调控机制,对水杨酸处理后的暴马桑黄菌丝进行转录组和代谢组检测,分析水杨酸调控暴马桑黄三萜合成的作用机制和关键基因功能。主要研究结果如下:（1）水杨酸对暴马桑黄三萜含量的影响在暴马桑黄液体发酵培养过程中添加水杨酸可以提高菌丝三萜含量,当水杨酸终浓度为350μmol/L,处理时间为4 d时,三萜含量最高为12.89 mg/g,比未处理组提高64.62%。（2）基于转录组和代谢组解析水杨酸处理下暴马桑黄三萜合成机制对水杨酸处理后的暴马桑黄菌丝进行了转录组测序分析发现桑黄三萜合成只通过MVA途径而不是MEP途径。通过KEGG富集分析发现在萜类骨架生物合成途径中的差异表达基因为AACT、HMGS1、HMGR、PMK、MVD、FPS和GGPS,随着水杨酸处理时间的延长,大部分基因逐渐上调表达,其中FPS在水杨酸处理4 d时基因表达量增加最为显著,是未处理组的3.8倍。在三萜生物合成途径,差异表达的基因只有LS,其基因表达量是未处理组的2.1倍。进一步对水杨酸处理后的暴马桑黄菌丝进行了代谢组检测分析,KEGG富集分析发现差异代谢物主要集中在综合途径、萜类和多酮类化合物代谢、辅助因子和维生素的代谢通路中。关联分析发现水杨酸处理暴马桑黄菌丝后萜类骨架合成途径中一些基因表达量升高,同时一些萜类前体异戊烯焦磷酸和牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸含量显著提高,并且检测到其下游的三萜、二萜、倍半萜及类胡萝卜素含量升高。因此推测水杨酸处理暴马桑黄三萜后导致萜类相关途径基因表达量升高,促进萜类前体合成,最终产生了更多的萜类物质。（3）暴马桑黄三萜合成关键基因克隆、序列分析及表达特性研究基于转录组和代谢组分析结果,选择AACT、FPS和LS基因进行基因克隆和生物信息学分析,AACT c DNA序列长1 260 bp,编码420个氨基酸。FPS c DNA序列长1 062bp,编码354个氨基酸。LS c DNA序列长2 229 bp,编码743个氨基酸。对三个基因进行原核表达发现AACT蛋白表达量随着诱导时间的增长而逐渐增大,FPS和LS蛋白表达量受诱导时间影响不大,但总体表达量较高。（4）暴马桑黄遗传转化体系的建立目前关于暴马桑黄萜类相关基因功能研究还比较少,主要原因是遗传转化体系的缺乏。本研究首先将p CAMBIA-1301的35S启动子替换为暴马桑黄gpd启动子,构建暴马桑黄p1301-SH-gpd转化载体。将载体转入EHA105农杆菌感受态用于侵染,并将暴马桑黄菌丝用匀浆仪在无菌条件下匀浆20 s,收集沉淀菌丝作为遗传转化受体。农杆菌侵染菌丝时间为20 min,共培养48 h后覆盖15 m L低溶点PDA培养基,置于25℃培养3～4 d,长出新菌落。将新菌落转移到潮霉素抗性PDA培养基中,经PCR验证成功获得阳性转化子,根癌农杆菌介导的暴马桑黄遗传转化体系构建成功。（5）FPS基因在暴马桑黄中过表达利用构建的遗传转化体系将FPS基因转入暴马桑黄中,成功获得FPS过表达菌株。在过表达菌株中,FPS及其下游基因表达量均有提升,并且三萜含量比野生型提高了36.98%。
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