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目的:单纯疱疹病毒性角膜炎(herpes simplex keratitis,HSK)是由I型单纯疱疹病毒(herpes simplex virus,HSV-1)感染引起的严重致盲性眼病,是当今世界患病率最高的感染性角膜疾病。在美国每年约有59万新发病例,近年的发病率约为11.8/10~5;在我国人群中HSK的患病率约为11/10~4。HSK主要表现为角膜神经退行、新生血管、炎症反应等,可导致角膜瘢痕化甚至失明,最终需要角膜移植手术才能重获光明。目前HSK的治疗主要依赖于核苷类似物抗病毒药物,例如更昔洛韦和阿昔洛韦等,缺乏有效缓解角膜症状的药物。色素上皮细胞衍生因子(pigment epithelium derived factor,PEDF)具有神经营养作用,还具有很强的抑制血管形成作用,已在脉络膜新生血管形成及糖尿病相关眼病等方面得到证实。血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide,VIP)是神经元分泌的可与免疫系统双向沟通的内源宿主防御蛋白,能够参与调节炎症反应。然而两者在HSK中的表达及作用尚无研究报道,具有广阔的研究前景。本研究通过构建小鼠HSK模型,观察HSK初发感染中角膜神经退行与新生血管病理变化;分别检测PEDF和VIP在HSK病程中的表达变化,观察外源性PEDF和VIP对HSK临床症状的影响并探讨了其调控神经退行、新生血管和炎症反应的分子机制,为单纯疱疹病毒性角膜炎的治疗提供新的干预策略。方法:1、小鼠HSK模型的建立及病程观察本研究采用6-8周龄C57BL/6小鼠,使用25G针头划线法接种HSV-1病毒McKrae株,建立HSK模型。裂隙灯显微镜观察术后3、7、15、45天小鼠角膜感染症状变化,并对角膜透明度及新生血管生长情况进行评分。利用β-Ⅲ tublin和CD31抗体角膜铺片免疫荧光染色客观评价HSK小鼠角膜神经和新生血管变化情况,并使用角膜敏感度测量仪测量角膜知觉变化。利用空斑试验对HSK病程中各时间点HSV-1病毒量进行检测。2、PEDF和VIP在小鼠HSK病程中的表达变化建立小鼠HSK模型,术后第0、3、7、15、45天取角膜,采用角膜冰冻切片免疫荧光染色方法观察角膜中PEDF和VIP的表达位置及表达量情况;RT-qPCR和ELISA方法检测各时间点PEDF和VIP的mRNA和蛋白表达情况。3、外源性PEDF及其衍生物和VIP对小鼠HSK的治疗作用建立小鼠HSK模型,将小鼠随机分为实验组和对照组,实验组于建模当天和建模第3天分别结膜下注射PEDF、PEDF衍生物和VIP,对照组结膜下注射等体积PBS,裂隙灯显微镜观察术后第3、7天HSK临床症状变化并进行临床评分;利用β-Ⅲ tublin和CD31抗体角膜铺片免疫荧光染色评价HSK小鼠角膜神经和新生血管变化情况,并使用角膜敏感度测量仪测量角膜知觉变化。4、PEDF和VIP对小鼠HSK病程中炎性细胞浸润和细胞因子的影响建立小鼠HSK模型,将小鼠随机分为实验组和对照组,实验组于建模当天和建模第3天分别结膜下注射PEDF和VIP,对照组结膜下注射等体积PBS,于建模后第3、7天取角膜,分别用角膜冰冻切片免疫荧光染色法和流式细胞术检测角膜中的中性粒细胞、巨噬细胞、CD4~+等细胞浸润情况;利用ELISA方法对各组角膜中各细胞因子表达变化情况进行检测。5、PEDF和VIP对HSV-1病毒复制的影响建立小鼠HSK模型并随机分为实验组和对照组,实验组于建模当天和建模第3天分别结膜下注射PEDF和VIP,对照组结膜下注射等体积PBS,于建模后第3、7天取各组角膜,利用角膜冰冻切片免疫荧光染色观察HSV-1病毒在角膜中的分布情况;利用空斑试验检测第3天各组病毒载量;利用RT-qPCR检测各组角膜中病毒相关基因ICP0和UL41表达量;体外抗病毒实验以Vero细胞为载体,感染HSV-1后加入不同浓度药物干预,收取细胞后利用RT-qPCR和空斑试验检测病毒含量。结果:1、小鼠HSK模型病程观察及PEDF和VIP的表达情况(1)裂隙灯显微镜下观察结果显示,正常角膜透明无血管。病毒感染第3天时角膜轻度水肿,新生血管产生。感染第7天时表现为严重的角膜水肿混浊伴大量新生血管生成。第15天角膜水肿消退,新生血管退缩。第45天角膜恢复透明,新生血管完全消失。(2)β-Ⅲ tublin抗体角膜铺片免疫荧光染色结果显示,正常角膜的基底膜下神经和基质中神经分支密集。病毒感染后第3天角膜神经开始退行同时伴随角膜中央敏感度下降。病毒感染第7天角巩膜缘的大神经纤维、基底下神经丛和上皮内神经末梢几乎全部消退,角膜中央敏感度降至最低。病毒感染第15天部分神经开始恢复,角膜中心的中、后基质可观察到再生的神经纤维,但未见上皮/基质交界处神经丛修复,角膜中央敏感度仍很低。病毒感染第45天可见再生的神经在角膜基质内密集分支,但上皮下位置的细神经束均未恢复,角膜中央敏感度无法恢复到感染前水平。(3)CD31抗体角膜铺片免疫荧光染色结果显示,正常角膜透明无血管。病毒感染第3天角膜缘新生血管芽生成。第7天大量新生血管生成,旺盛粗大,向角膜中央生长。第15天新生血管变细变短,开始萎缩消退。45天时可见新生血管基本退行至角膜缘,接近正常角膜无血管状态。(4)空斑试验结果显示,小鼠角膜感染HSV-1后第3天病毒载量最高,约为40 pfu/ml,第7、15、45天病毒量均显著下降。(5)免疫荧光染色结果显示,在正常小鼠角膜中PEDF主要表达在角膜上皮和角膜内皮,HSV-1感染后第3天和第7天PEDF表达量下降,第15天表达上升,45天又降至正常水平。PCR和ELISA结果与免疫荧光结果一致。(6)免疫荧光染色结果显示,在正常小鼠角膜中VIP少量表达在角膜神经纤维中,HSV-1感染后在角膜基质炎症细胞中也有表达。ELISA结果显示病毒感染第3天VIP表达量升高,第7天表达量下降,第15天VIP表达量再次升高,第45天降至正常水平。2、外源性PEDF对小鼠HSK的治疗作用(1)与PBS对照组相比,PEDF给药组第3、7天,角膜水肿减轻,新生血管减少,临床评分下降,角膜神经密度增加,角膜中央敏感度提高(p<0.05)。(2)免疫荧光染色和流式细胞术结果显示,病毒感染后第7天,PEDF给药组角膜中的中性粒细胞浸润显著减少(p<0.05),巨噬细胞和CD4~+T细胞无显著变化(p>0.05)。(3)ELISA和RT-qPCR结果显示,病毒感染后第7天,PEDF给药组角膜中VEGF显著下调(p<0.05),细胞因子IL-1β,IL-6和TNF-α显著下调(p<0.05)。(4)角膜HSV-1免疫荧光染色结果显示,病毒感染后第3、7天PEDF给药组荧光强度明显减弱。空斑试验结果显示,PEDF给药组病毒载量明显降低(p<0.05)。RT-qPCR检测结果显示PEDF给药组病毒相关基因ICP0和UL41表达量下降(p<0.05)。体外抗病毒实验发现,PEDF浓度为25 ng/ml时能够最大程度抑制HSV-1复制。(5)PEDF衍生肽Mer44和Mer34分别结膜下注射给药后观察发现,病毒感染后第3天各组临床症状无显著差异,第7天各组间神经退行和新生血管具有显著差异(p<0.05)。Mer44和Mer34给药组角膜临床症状均较对照组有所减轻,临床评分下降(p<0.05),角膜中央敏感度提升(p<0.05)。但Mer44给药组神经保护作用更为明显,Mer34给药组抑制新生血管作用更明显。3、外源性VIP对小鼠HSK的治疗作用(1)病毒感染后第3、7天,VIP给药组比PBS对照组角膜水肿减轻,新生血管减少,临床评分下降,角膜神经密度增加,角膜中央敏感度有所提高(p<0.05)。(2)免疫荧光染色和流式细胞术结果显示,HSV-1感染后第3、7天VIP给药组中性粒细胞的浸润均较PBS组明显减少(p<0.05);第7天CD4~+T细胞浸润也显著减少(p<0.05);ELISA结果显示,病毒感染后第7天VIP给药组角膜内髓过氧化物酶MPO的活性显著降低(p<0.05);(3)角膜冰冻切片免疫荧光染色和ELISA结果显示,病毒感染后第3、7天,与对照组相比VIP给药组角膜中TGF-β表达量显著上调(p<0.05);(4)ELISA结果显示,病毒感染后第7天,与对照组相比VIP给药组角膜中IL-17、IL-17F表达下降(p<0.05),IL-6、IL-10、IL-12、IL-23、IL-28、IFN-γ表达上升(p<0.05);(5)角膜HSV-1免疫荧光染色结果显示,病毒感染后第3、7天,VIP给药组和PBS对照组HSV-1荧光强度未见显著差异。空斑试验结果显示,感染后第3天两组病毒载量无显著差异(p>0.05)。RT-qPCR检测两组HSV-1病毒相关基因ICP0表达量无显著差异(p>0.05)。结论:1、本研究通过建立小鼠HSK模型,观察了HSV-1初发感染过程中角膜症状及神经和新生血管的变化,发现感染后第7天角膜神经退行和新生血管变化最显著。2、PEDF在HSK病程中的表达变化与临床症状变化相符;外源性PEDF在小鼠HSK模型中可起到保护神经、抑制新生血管、减轻临床症状的作用。这种作用与减少中性粒细胞浸润,降低VEGF和炎性因子表达,以及抑制HSV-1病毒复制密切相关。3、VIP在小鼠角膜中少量表达,外源性VIP在小鼠HSK模型中可起到保护神经、抑制新生血管、减轻角膜临床症状的作用。这种作用主要与减少中性粒细胞和CD4~+T等细胞浸润,下调MPO及IL-17等促炎因子表达,上调TGF-β及抗炎因子表达的免疫调节作用有关。