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【目的】研究金雀异黄素(genistein)与化疗药5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-Fu)联合应用对人结肠癌细胞株SW480生长的协同抑制作用,探讨genistein提高结肠癌细胞对5-Fu的敏感性,以及促进结肠癌细胞凋亡的分子机制,为临床增强大肠癌化疗疗效提供重要的理论依据。【方法】实验分为4组:对照组(不加药组)、5-Fu单药组、genistein单药组、5-Fu+genistein双药组。采用MTT法检测不同浓度genistein和5-Fu单用或联用对结肠癌细胞株SW480的抑制作用;原位末端脱氧核糖核酸转移酶标记DNA链断端分析法(terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dutp-biotin nick end-labeling assay, TUNEL)检测结肠癌细胞的凋亡情况,并在透射电镜下观察凋亡细胞超微结构的改变;流式细胞术(flow cytometry, FCM)分析药物作用后细胞周期的改变;实时定量PCR检测各组细胞survivin、Bcl-2、p21、caspase3和caspase 9基因表达情况;Western blot检测各组细胞survivin、Bcl-2、p21、caspase3和caspase 9蛋白表达情况;电泳迁移率改变分析(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)检测NF-κB的DNA结合活性。【结果】1.经MTT检测,genistein和5-Fu单独作用于SW480细胞24h、48h、72h、96h后,均显示剂量依赖性和时间依赖性的生长抑制作用。2.两药联合作用经拉丁方排列组合处理,计算两药联合作用的q值,其中以genistein 80μmol/L和5-Fu 30μg/mL联合作用48h的q值最高,为1.618。3. TUNEL检测结果显示,genistein单药组凋亡指数(AI)为(10.32±1.26)%,5-Fu单药组为(16.45±2.56)%,双药组为(29.32±5.65)%,而对照组仅为(1.28±0.55)%,四组间AI值比较差异有统计学意义,F=49.780,P<0.001,其中联合作用组与对照组及两个单药组比较差异均有统计学意义(P<0.001)。4.透射电镜观察到凋亡细胞核电子密度增加,核碎裂,可见凋亡小体,以双药联用为著。5. FCM分析对照组、5-Fu组、genistein组和5-Fu+genistein组四组细胞周期改变,G1期细胞数分别为46.0%、43.2%、21.0%和15.4%,S期细胞数从40.0%降低为19.0%、24.5%和36.4%,而G2期细胞数从14.1%增加为27.8%、54.5%和48.2%,表明SW480细胞经genistein处理后细胞生长阻断于G2期。6.实时定量PCR检测显示:双药组与对照组、5-Fu单药组、genistein单药组的caspase3、caspase9、p21基因的2-ΔΔCT值相比明显增高,差别有统计学意义(P<0.05);双药组与对照组及两个单药组的survivin基因的2-ΔΔCT值相比有明显降低,差别均有统计学意义(P<0.05)。双药组与对照组、genistein单药组的Bcl-2的2-ΔΔCT值相比明显降低,差别有统计学意义(P<0.05),但与5-Fu组的Bcl-2的2-ΔΔCT值相比没有统计学意义(P>0.05)。7. Western blot检测显示:双药组与对照组、5-Fu单药组、genistein单药组的caspase3、caspase9、p21的灰度比值相比明显增高,差别有统计学意义(P<0.05);双药组与对照组及两个单药组的survivin灰度比值相比有明显降低,差别均有统计学意义(P<0.05)。双药组与对照组、genistein单药组的Bcl-2的灰度比值相比明显降低,差别有统计学意义(P<0.05),但与5-Fu组的Bcl-2的灰度比值相比没有统计学意义(P>0.05)。8. EMSA检测显示与对照组相比,5-Fu组、genistein组和联合用药组的核内NF-κB表达均降低,其中genistein组显著降低NF-κB的表达,5-Fu对NF-κB的改变较小,二者联用的时候显著减低NF-κB的表达。考虑genistein可能减少NF-κB(p65)的核移位,抑制NF-κB的抗肿瘤细胞凋亡作用,增强癌细胞对5-Fu的化疗敏感性。【结论】genistein联合5-Fu可显著抑制大肠癌细胞的生长,二者具有协同作用,其作用机制可能有:genistein通过抑制NF-κB信号转导通路,增强结肠癌细胞对5-Fu的敏感性,并通过激活caspase-3、caspase9、p21基因,下调survivin基因促进结肠癌细胞的凋亡。提示genistein可作为结肠癌化疗的重要辅助治疗手段,为临床增强大肠癌化疗疗效奠定理论基础。