抗Ⅳ型胶原酶单域抗体V<,H>导向的力达霉素基因工程菌株的构建及融合蛋白CagA-V<,H>的表达研究

来源 :北京协和医学院 中国医学科学院 清华大学医学部 | 被引量 : 0次 | 上传用户:zxg668888
下载到本地 , 更方便阅读
声明 : 本文档内容版权归属内容提供方 , 如果您对本文有版权争议 , 可与客服联系进行内容授权或下架
论文部分内容阅读
力达霉素(lidamycin,LDM),原名C-1027,是一种新型的烯二炔类抗肿瘤抗生素,由球孢链霉菌C-1027(StreptomycesglobisporusC-1027)产生。其抗肿瘤活性比临床常用的阿霉素强10,000倍,已经进入临床II期试验。力达霉素由一个酸性辅基蛋白CagA(C-1027apoprotein、C-1027AG,也写作LDP)和一个烯二炔结构的发色团(chromophore,也写作LDC)非共价结合组成,发色团为活性组分,辅基蛋白保护和运载发色团。由于力达霉素自身具有辅基蛋白,可以将其与抗肿瘤抗体偶联成为融合蛋白,改造为靶向特异肿瘤的载体,构建导向性力达霉素。IV型胶原酶降解细胞基底膜中的Ⅳ型胶原,破坏基底膜及细胞外基质的完整性,引起肿瘤细胞的侵袭与转移,IV型胶原酶已经成为抗肿瘤研究的靶标。抗IV型胶原酶抗体可以抑制IV型胶原酶的活性并可作为导向药物的载体。   本工作根据已知的抗IV型胶原酶单链抗体基因序列,设计合成了具有链霉菌偏好密码子的抗IV型胶原酶单域抗体VH(抗IV型胶原酶抗体重链可变区)基因,构建了含有辅基蛋白与抗IV型胶原酶单域抗体融合蛋白基因cagA-VH和用于筛选的阿普霉素抗性基因aac(3)IV的重组质粒pBSH,用接合转移的方法导入力达霉素产生菌S.globisporusC-1027,通过同源重组双交换,以cagA-VH-aac(3)IV取代力达霉素生物合成基因簇中原有的辅基蛋白基因cagA,得到基因工程菌株S.globisporusC-1027VH,以获得Ⅳ型胶原酶靶向的力达霉素。对基因工程菌株进行发酵,以枯草杆菌(Bacillussubtilis)为检定菌,结果表明基因工程菌株发酵液具有一定的抑菌活性,但与原产生菌相比活性较低。经Westernblot分析在胞内能检测到融合蛋白和降解的辅基蛋白,而胞外仅检测到降解的辅基蛋白条带。ELISA检测到融合蛋白的免疫活性。同时构建了含有融合蛋白基因cagA-VH但不含抗性基因的重组质粒pBS03H,通过同源重组双交换,以cagA-VH基因取代cagA基因,得到仅融合了抗IV型胶原酶单域抗体基因的基因工程菌株S.globisporusC-1027NVH。同样进行了发酵、抑菌活性、SDS-PAGE和Westernblot的检测,结果与S.globisporusC-1027VH基本相同。   为了增加融合蛋白的表达量,获得高活性的导向性力达霉素,本工作进一步构建了辅基蛋白阻断株,并通过导入多拷贝的融合蛋白表达质粒的策略来提高融合蛋白的表达量。构建重组质粒pBSA,将质粒接合转移至S.globisporusC-1027中,采用同源重组双交换的方法将cagA基因阻断。通过抗性筛选、PCR和Southernblot验证,最终获得辅基蛋白阻断株,命名为S.globisporusAKO。用四种辅基蛋白表达质粒pKCTA900、pSETTA900、pLTA900和pLTA400分别导入在自身启动子和/或强启动子控制下的cagA基因对阻断突变株S.globisporusAKO进行互补,得到相应的互补菌株。对阻断株和互补菌株进行发酵,发酵液的抑菌活性和HPLC分析结果表明阻断株完全丧失了力达霉素的产生能力,而互补菌株能不同程度地恢复产生力达霉素,其中S.globisporusAKO/pKCTA900基本恢复到野生株的水平。将质粒pKCA900、pSETA900、pLA900和pLA400接合转移至野生株S.globisporusC-1027中构建了相应的辅基蛋白过表达菌株。抑菌活性和HPLC分析结果表明过量表达cagA基因可以提高力达霉素的产量。   构建辅基蛋白.单域抗体的融合蛋白表达质粒pKCTH2600、pSETTH2600分别导入辅基蛋白阻断株中进行表达。重组菌株S.globisporusAKO/pKCTH2600发酵液的抑菌活性在发酵晚期与野生株相当,经Western1blot分析在胞内、胞外均能检测到融合蛋白的特异条带。ELISA检测到融合蛋白的免疫活性。结果表明融合蛋白在辅基蛋白阻断株中以多拷贝质粒的形式获得表达且表达量较基因工程菌株S。globisporusC-1027VH和S.globisporusC-1027NVH明显提高。   综上所述,本工作通过优化融合基因的表达策略,提高了融合蛋白的表达水平,为获得抗IV型胶原酶单域抗体VH导向的力达霉素奠定了基础,为进一步构建高表达的导向力达霉素重组菌株提供了新的技术平台。
其他文献
马克思主义意识形态是高校思想政治理论课的核心内容,是形成学生正确人生观、世界观和价值观的重要指导思想,原本应该受到强化而不是淡化与弱化.不过环视当下高校思想政治理
在中国这个人口13亿的国家,专业或者半专业运动员的数量是非常庞大的。但是在“金牌效应”的体制下,我们往往单纯通过竞技水平来判断一位运动员的高低,却忽略了运动员对于文
里昂宣言以信息获取和发展为主题,强调增强人们的信息获取能力,促进发展;强调要通过创造就业机会,推动和保障平等地获取信息等举措来促进人权的保障等。图书馆界的工作者有必
随着计算机网络技术的普及和发展,全国各地的高校图书馆陆续将计算机技术运用于编目工作中,日文编目工作也进入一个新的时代.计算机日文编目也随其广泛应用出现了许多问题.拥
毛喉鞘蕊花Coleus forskohlii(Willd)Briq.系唇形科Labiatae鞘蕊花属Coleus Lour.植物,产于印度和我国云南省等地,主要用于治疗感冒、咳喘等疾病。目前,国产毛喉鞘蕊花的产品
目的分别复制四氯化碳(CCl_4)、乙醇及对乙酰氨基酚(acetaminphen,APAP)的肝损伤病理模型,探讨左卡尼汀(L-carnitine,LC)对肝损伤的保护作用及机制。方法分别复制CCl-4诱导的急、慢性肝损伤(小鼠按10 ml·kg~(-1)腹腔注射0.1%CCl_4,大鼠慢性肝损伤按2ml·kg~(-1)皮下注射25%CCl_4,大鼠急性肝损伤按1ml·kg~(-1)皮下注射CCl
中药现代化是时代发展的必然要求,中药制剂现代化是中药现代化的前提与基础。本研究根据中医临床用药的需要,以具有抗肿瘤作用的中药珍珠菜为模型药物,采用现代制剂的新方法、新技术、新辅料、新设备,开发研究了一种符合中药特点的中药缓释制剂,并制订科学严格的质量控制标准,使其达到“安全、有效、稳定、可控”,能更有效地发挥中药在防治疾病中的作用特点。采用紫外分光光度法,建立了珍珠菜有效部位提取物及其制剂的含量和
目的:格列喹酮(Gliquidone)是第二代磺酰脲类口服降血糖药。本课题旨在建立健康人血浆中格列喹酮的液相色谱-质谱(LC-MS/MS)测定方法,并进行格列喹酮片(糖适平)与格列喹酮分散片在中国健康受试者体内的药代动力学和生物等效性研究。方法:以北京万辉双鹤药业有限责任公司生产的格列喹酮片(糖适平)做参比制剂,采用两制剂双周期随机交叉试验设计,研究格列喹酮分散片的生物等效性。20例健康男性受试者
期刊
期刊