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猪乙型脑炎病原为日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV),属于黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属,该属包括黄热病(Yellow fever virus)、日本乙脑病毒(JEV)、西尼罗河病毒(West nile virus)和登革热病毒(Degue virus)等多种严重危害人畜健康的病毒。目前预防猪乙型脑炎主要靠接种疫苗和防蚊灭蚊。本研究初步探索了乙型脑炎颗粒疫苗以及新型乙脑病毒灭活剂的效果,HBC是乙型肝炎核心抗原,其在多种表达体系中均被表达并能自组装成病毒样颗粒,是一种良好的表位展示免疫载体。另外据报道作为病毒灭活剂的双氧水能快速有效灭活病毒,并且对病毒表面结构的破坏相对传统灭活剂-甲醛要小很多,本实验对以双氧水为灭活剂的猪乙型脑炎灭活苗进行初步研究。1展示JEV EDIII loop3表位的病毒样颗粒的制备及其免疫效果研究JEV E蛋白结构域Ⅲ(EDⅢ)是诱导中和抗体的重要区域。据报道,体外实验表明EDIII的一个环肽(loop3)能通过干扰病毒吸附细胞抑制病毒感染,接种该蛋白之后对小鼠的攻毒实验表明loop3是保护性最强的一段多肽。但Ioop3表位肽只是一段仅有9个氨基酸残基的序列,该表位肽的免疫原性极低。乙肝核心蛋白(Hepatitis Bcore protein, HBC)是乙肝病毒的重要结构蛋白,它在细菌、真核细胞以及哺乳动物细胞内均能被高效表达并自动装配成病毒样颗粒,而且在HBC特定位置插入的外源短肽序列不会影响HBC的构象及自我组装,同时插入的外源短肽能以多次重复的方式被展现在病毒样颗粒表面,从而能大大提高表位肽的免疫原性。因此将loop3基因与HBC基因重组,以该颗粒物质为免疫载体,提高loop3表位的免疫原性。根据以上所述,本文首先构建了以HBC为载体的重组融合表达质粒pET28a-HBC-loop3,在HBC的MIR区插入JEV EDIII loop3表位基因。SDS-PAGE证明,IPTG诱导后大肠杆菌高效上清表达了目的蛋白,表达量较高,命名为HBC-loop3,纯化过后,在透射电镜下观察,视野中具有大量病毒样颗粒,证实了该该融合蛋白能自行组装成病毒样颗粒。将纯化的HBC-loop3辅以弗氏佐剂免疫5只5周龄清洁级小白鼠,接种部位为腹膜腔,接种蛋白量为50μg。然后利用本实验室建立的间接ELISA法以及血凝抑制法和空斑中和试验来评价免疫效果,结果为：蛋白免疫组抗体ELISA值(0.59)显著大于PBS组值(0.18),蛋白免疫组血清的血凝抑制效果也高于PBS组,而空斑抑制试验显示血清中未检测到中和抗体。2以双氧水为灭活剂的猪乙型脑炎病毒灭活苗试制与初步效果试验本研究中使用的是免疫原性良好的猪源乙脑病毒-NANJING08株。本实验用过氧化氢和甲醛分别灭活JEV病毒,然后辅以弗氏佐剂免疫5只5周龄清洁级小白鼠,接种部位为腹膜腔,接种病毒剂量为1×106PFU,运用间接ELISA法、血凝抑制法和空斑中和试验对免疫效果进行评价。ELISA结果显示双氧水灭活组ELISA值(1.20)略高于甲醛灭活组(1.10)；血凝抑制实验结果显示双氧水灭活病毒产生血凝抑制价略高；最后蚀斑中和实验证了双氧水灭活病毒抗原能诱导产生更高的中和抗体水平。初步研究结果表明,过氧化氢能有效的灭活乙脑病毒,并且以过氧化氢为病毒灭活剂制备的乙型脑炎灭活疫苗,能诱导产生更高的保护性抗体水平,因此过氧化氢是一种很有应用前景的乙型脑炎疫苗灭活剂。