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研究背景:骨性关节炎（Osteoarthritis,OA）是好发于负重关节的慢性退行性疾病,临床上常出现关节疼痛反复发作、关节活动障碍且不断加重等症状。一般说来,随着年龄增长,骨关节炎发病率会逐渐增加。目前,尚没有有效药物预防关节软骨退行性病变。多种危险因素与骨关节炎进程相关,但是,骨性关节炎发病机理仍不十分清楚。因此,从软骨细胞损伤的角度阐明OA的发病机制具有重要的意义,将为OA的预防和干预治疗提供实验依据。FGF-18是成纤维细胞生长因子家族的成员之一,其在骨骼发育、生长期软骨形成和成骨生成中发挥重要作用,在OA治疗中被认为是极具潜力的治疗靶点。目前国际上也有针对该靶点的蛋白药物进入临床研究阶段。默克公司在研的一款创新药物为截短的重组人FGF-18蛋白,从公布的二期临床数据来看,该药物可有效诱导软骨细胞增殖和促进细胞外基质生成,进一步增加软骨厚度,具有良好的促进关节疾病修复的潜力。目前,国内尚没有FGF18重组蛋白药物进入临床试验阶段。因此,开发自主产权的FGF18重组蛋白对于提升我国在关节炎治疗药物方面的竞争力具有重要意义。miRNA是一类非编码RNA,长度约为19-25bp,其能够与靶基因的3’-UTR结合,从而在转录后水平调控靶基因的表达。最近的证据表明,多种miRNAs如miR-139、miR-140、miR-27a-3p、miR-634在OA的进程中发挥重要作用。某些miRNA能够通过多种途径抑制OA进展,而在OA模型或者临床组织中表达下降。另有一些miRNA在OA疾病进展过程中表达升高,可通过调控不同靶基因加速疾病进程。尽管围绕miRNA在OA诊疗领域的研究较多,但是已被鉴定的可靶向FGF18的miRNA分子研究较少。目前,仅有两种miRNA分子被认为能够靶向FGF18,分别是miR-195和miR-21-5p。鉴于FGF18分子在OA治疗中的关键作用,进一步鉴定并寻找其上游miRNA分子,对于探究OA病理机制乃至核酸药物开发至关重要。研究目的:（一）本研究旨在构建FGF18表达载体,制备重组人FGF18蛋白,初步确定冻干制备工艺,并分析FGF18蛋白在体外实验和大鼠关节炎模型中对软骨细胞的修复作用。（二）鉴定并分析靶向FGF18的关键miRNA分子;分析候选分子miR-590-5p靶向FGF18对软骨损伤的生物学作用和作用机制,从而为OA疾病寻找新的治疗靶点提供理论依据和实验数据。研究方法:（一）重组FGF18促进软骨修复的体内外作用研究 首先,利用原核表达系统构建pET-11a（+）/FGF18大肠杆菌重组表达载体,进行重组FGF18蛋白的表达和纯化;通过优化包涵体变性、蛋白复性及纯化条件提高包涵体表达复性率及FGF18纯度和收率,以收获纯度较高FGF18蛋白;进一步优化冻干工艺为FGF18重组蛋白药物开发提供重要数据。其次,通过电转的方式过表达不同FGF受体亚型表达载体,并用递增浓度的重组FGF18蛋白进行处理,CellTiter-Glo（?）检测试剂盒分析细胞活力,从而明确制备的重组FGF18通过何种受体发挥作用。然后,采用CellTiter-Glo（?）检测试剂盒分析重组FGF18蛋白对软骨细胞增殖能力的影响;番红-O染色法观察制备的重组FGF18对软骨细胞蛋白多糖分泌的影响;利用RT-PCR方法分析FGF18对软骨细胞Collagen-Ⅱ和Aggrecan表达的影响。体内实验中,采用半月板撕裂法建立大鼠关节炎动物模型,比较腹腔注射和静脉注射、皮下给药及关节腔给药途径对大鼠血清FGF18浓度和大鼠体重的影响。利用番红-O染色和HE染色分析FGF18重组蛋白不同给药方式对大鼠软骨修复的影响。（二）miR-590-5p靶向FGF18抑制软骨修复的作用机制研究 首先,利用IL-1β处理原代软骨细胞,采用CCK-8法分析细胞活力,通过RT-PCR和 Western blot 方法检测 FGF18 的表达;进一步利用 Target Scan Human 7.2、mirDIP、microRNA.org及miRDB预测能够靶向FGF18的候选miRNA,初步发现miR590-5p与FGF18的3’-UTR具有潜在结合位点。RT-PCR方法分析miR-590-5p在11组正常和OA软骨组织以及IL-1β处理软骨细胞中的表达水平。接下来,通过在原代软骨细胞中转染miR-590-5p模拟物和抑制物,采用CCK-8法检测细胞活力;RT-PCR和Western blot方法分析不同处理组凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3的基因和蛋白表达水平;ELISA方法检测不同处理组中促炎因子IL-6、TNF-α和IL-8的含量;RT-PCR和Western blot方法分析不同处理组中ADAMTS5、Collagen Ⅱ表达水平。最后,分析miR590-5p与FGF18 3’-UTR的结合位点,构建FGF18 3’-UTR的荧光素酶报告载体和突变载体,进而采用荧光素酶报告实验研究miR-590-5p对FGF18的调控作用。在原代软骨细胞中过表达或沉默miR-590-5p,利用RT-PCR和Western blot方法检测FGF18的基因和蛋白表达水平。实验结果:（一）重组FGF1 8蛋白的制备以及体内外促进软骨修复作用研究成功构建了 pET-11a（+）-FGF18大肠杆菌重组表达载体,电泳和测序均显示构建成功。通过优化包涵体变性、蛋白复性及纯化条件,获得高纯度FGF18重组蛋白。通过工艺优化,确定可用于FGF18冻干的实验条件。过表达 GFR1b、FGFR2b、FGFR1c、FGFR2c、FGFR3b、FGFR4 等不同 FGF 受体亚型的表达质粒。结果发现,随着FGF18浓度增加,转入FGFR3c能显著提高BaF3细胞活力,而转入其他FGFR后,再用递增剂量的FGF18重组蛋白进行处理,细胞活力并未发生显著改变。制备的重组FGF18蛋白处理原代软骨细胞后,软骨细胞的活力相较于对照组显著升高;番红-O染色结果显示,FGF18处理组显示出较深的染色强度。此外,FGF18处理后,软骨细胞Aggrecan和Collagen Ⅱ基因表达水平显著升高。成功建立大鼠关节炎模型后,通过腹腔注射、静脉注射、皮下给药及关节腔给药等不同途径对大鼠进行FGF18重组蛋白处理。结果发现,关节腔给药对大鼠体重影响较小;并且,关节腔给药FGF18的软骨增生效果优于皮下注射和静脉注射给药方式。（二）miR-590-5p靶向FGF18抑制软骨修复的作用机制研究 利用IL-1β处理原代软骨细胞后,细胞活力显著下降,且FGF18表达水平明显受到抑制。进一步利用 TargetScanHuman 7.2、mirDIP、microRNA.org 和 miRDB 软件预测到4 种 miRNA 包括 hsa-miR-590-5p、hsa-miR-1297、hsa-miR-330-5p 以及 hsa-miR-326 与FGF18 mRNA的3’-UTR存在潜在结合位点,其中miR-590-5p结合指数较强。IL-1β处理原代软骨细胞后,4种miRNA中以miR-590-5p表达升高最为显著。当转染miR-590-5p模拟物后,IL-1β处理组软骨细胞活力进一步降低,且抗凋亡基因表达下降,促凋亡基因表达显著升高。转染miR-590-5p抑制物后,由IL-1β处理导致的细胞活力下降得到显著逆转,且抗凋亡基因的表达水平进一步升高,促凋亡基因表达受到显著抑制。ELISA结果显示,与单独IL-1β处理组相比,转染miR-590-5p模拟物后,软骨细胞培养上清中IL-6、IL-8及TNF-α水平明显升高;而miR-590-5p抑制物则能显著抑制上述炎症因子的分泌。值得关注的是,miR-590-5p模拟物能够抑制ADAMTS5、Collagen Ⅱ表达,而转染miR-590-5p抑制物后则取得相反的结果。荧光素酶报告基因结果显示,在软骨细胞转染miR-590-5p模拟物后,荧光素酶活性显著降低,而seed区发生突变的FGF18 mRNA 3’-UTR报告基因载体转染组中,同样转染miR590-5p模拟物,荧光素酶报告基因活性亦未受到影响。进一步分析发现,软骨细胞转染miR-590-5p抑制物后,荧光素酶活性显著升高,而突变的FGF18 mRNA3’-UTR报告基因载体转染组中,荧光素酶报告基因活性同样未受影响。此外,qPCR和Western blot结果显示,转染miR-590-5p模拟物后,软骨细胞中FGF18的mRNA和蛋白表达显著下降,而转染miR-590-5p抑制物后,则观察到相反的结果。结论:（1）成功制备重组FGF18蛋白,其能通过FGFR3c受体发挥作用;关节腔给药重组FGF18能够显著促进大鼠OA模型软骨修复;（2）miR-590-5p能够靶向FGF18 3’-UTR,进而调控软骨细胞增殖、凋亡和炎症反应,这为临床关节炎治疗提供了重要的新靶点。