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肺表面活性蛋白B(SP-B)来源于肺泡II型上皮细胞,是构成肺表面活性物质进化最早、不可或缺的疏水性蛋白之一。其主要功能是促进磷脂分子扩散,增加单分子膜的稳定性,提高脂质-蛋白复合物的表面活性,具有调节肺泡气液界面表面张力的功能。急性肺损伤(ALI)过程中炎症因子会导致肺泡Ⅱ型上皮细胞形态、功能发生变化,表面活性物质合成减少;而SP-B合成的减少、构像的改变及活性的降低,会进一步加重ALI的病理过程。重组瑞替普酶(r-PA)是第三代溶栓药物,能有效清除心、肺等部位血管中出现的凝血块,r-PA与SP-B的融合蛋白能为ALI替补治疗开发一个新型的基因工程药物。研究目的:本课题研究目的在于构建、表达r-PA与SP-B的融合蛋白,通过摸索SP-B融合表达的特性,使其既具有r-PA清除凝血块的作用,又具有SP-B表面活性功能的特点,为ALI替补治疗开发新型的基因工程药物。研究方法:(1)研究SP-B融合表达的特性。SP-B难以用常规氨基酸合成方法获得,先通过合成成熟SP-B的基因,构建在质粒pGEX4T-1上,将GST-tag与SP-B融合,后用IPTG诱导表达,利用Western Blot检测SP-B的表达,并纯化GST/SP-B蛋白。(2)构建r-PA/SP-B融合表达的载体。根据SP-B融合表达的特性,合成r-PA基因、r-PA/SP-B共表达基因,构建在真核载体pEZ-M03上,提取质粒后进行酶切鉴定、基因测序,而后转染到CHO-K1细胞中,细胞表达产物采用Western Blot检测。(3)r-PA/SP-B的细胞荧光定位。培养CCL149细胞,考察阳离子脂质体瞬时转染的条件及其转染效率之后,将融合表达载体通过转染的方法导入CCL149细胞中,利用载体上携带的eGFP,结合DAPI核染与DiI细胞膜染色,明确r-PA与r-PA/SP-B在细胞中的定位。(4)基于ALI的r-PA/SP-B功能的研究。构建急性肺损伤细胞模型,采用细胞拉曼光谱技术,分析质粒转染CCL149细胞后r-PA/SP-B融合蛋白与细胞膜磷脂结构的相互作用关系,采用纤维蛋白-琼脂糖平板法测定融合蛋白中r-PA的酶活性。研究结果:(1)采用较低温度、延长时间的方法,N-端的GST-tag可与C-端的SP-B融合,有助于促进重组SP-B在的可溶性表达,明确疏水性的SP-B能与亲水性、分子量较大的标签融合表达。(2)利用分子生物学技术分别构建了r-PA表达载体pEZ-rPA和r-PA/SP-B融合表达载体pEZ-rPA-SPB,且都在C端携带eGFP报告基因,利用酶切鉴定、基因测序等方法分析、证明了载体构建正确。经SDS-PAGE和Western Blot检测,表达产物可与r-PA抗体、SP-B抗体呈阳性反应,产物中存在r-PA蛋白和r-PA/SP-B融合蛋白。(3)pEZ-rPA表达的绿色荧光蛋白在CCL149细胞中的分布主要集中在细胞胞浆,pEZ-rPA-SPB表达的绿色荧光蛋白在CCL149细胞中的分布主要集中在细胞膜上,说明r-PA/SP-B融合蛋白在CCL149细胞中有特异性表达,并且融合蛋白上的SP-B能发挥其在细胞膜上的定位及功能。(4)筛选出适用于制备细胞损伤模型的LPS最优剂量——终浓度为10 ug/L;在LPS细胞损伤模型中,r-PA、r-PA/SP-B融合蛋白在细胞中的正常表达及功能没有明显受到LPS的影响,SP-B也没有失去膜结合能力。(5)通过r-PA/SP-B在肺泡Ⅱ型上皮细胞中的表达,r-PA的酶活性为3.80,r-PA/SP-B融合蛋白的酶活性为3.42。可以利用SP-B具有膜结合性的特点,维持细胞膜磷脂双分子层结构的稳定性,减少LPS等促炎因子对肺泡Ⅱ型上皮细胞造成的损伤。