研究背景与目的压力性尿失禁(SUI)指膀胱无自主收缩的情况下腹压突然增高导致尿液不自主流出，也称为真性压力性尿失禁、应力性尿失禁、张力性尿失禁，其特点为正常状态下无溢尿，而腹压增高时如咳嗽或剧烈运动时尿液自尿道外口不自主溢出[1,2]，以女性常见，约50%的老年妇女患有此病[3]，严重影响生活质量。导致SUI的关键机制为膀胱颈支撑功能障碍及尿道固有括约肌缺陷(ISD)。而ISD主要是由于尿道周围平滑肌细胞(SMC)的病变所致[4]。目前SUI的治疗方法超过200种[5]，包括手术治疗及非手术治疗。目前最常用的手术方式为无张力尿道中段悬吊带术。所用的吊带材料主要有：自体移植物(阴道壁、腹直肌筋膜、阔筋膜等)、同种异体移植物(来自尸体的真皮、硬脑膜、阔筋膜等)、异种移植物(猪膀胱、猪小肠粘膜下层、猪真皮、猪胆囊壁等)及合成材料(聚丙烯、聚酯等)。自体移植物虽避免了组织侵蚀的发生，但其机械强度偏弱，且需另作手术切口来获取移植物。同时有报道表明尸体来源的同种异体材料因磨损而导致早期手术失败并引起SUI再发。合成材料虽具备更好的机械强度及更强的持久性，但其术后吊带侵蚀、尿道周围慢性炎等并发症发生率高[6]。而异种移植物具备与合成材料相似的优点，且组织侵蚀、感染的发生率要低得多，但因其在体内降解性快，而最终导致远期疗效不佳。近年来随着组织工程技术的发展，使生物材料吊带应用于SUI成为可能。组织工程吊带的组织相容性、细胞结构的还原性均为合成材料所难以比拟的，其可克服目前吊带材料存在的缺陷，同时具备括约肌的收缩性，为括约肌受损和功能障碍型尿失禁的治疗提供良好的修复材料。组织工程吊带构建的两大关键环节为生物支架与种子细胞的选择。目前常用治疗SUI的种子细胞有肌源性干细胞(MDSCs)、脂源性干细胞(ADSCs)、骨髓间充质干细胞(BMSCs)。但MDSCs来源有限，而自体ADSCs注射可能导致转移性血管栓塞或肺栓塞等严重并发症，且从自体骨骼肌分离培养MDSCs与从自体脂肪分离培养ADSCs均会导致患者二次损伤[7-9]。而BMSCs易分离获得，并具有自我更新和多向分化潜能，可分化为多种细胞，包括SMC[10-11]。故本研究选择BMSCs来构建干细胞组织工程吊带的种子细胞。脱细胞基质是一种特殊天然的生物材料，其经理化方法去除生物体原组织中的实质细胞而制备得成，由多种生物大分子组成了三维网状结构，有利于细胞在其上的黏附、生长与增殖[12]。我们前期对目前较常用的5种脱细胞基质：小肠粘膜下层(SIS)、脱细胞真皮(ADM)、脱细胞膀胱(UBM)、脱细胞胆囊(CEM)及脱细胞心包(AP)，进行比较研究发现：UBM具有较长降解周期、较强抗菌性，其亲水性、组织相容性以及生物力学性能均较好[13]，且其来源于泌尿系统，对尿路周期细胞具潜在生物亲和优势，因此UBM是构建干细胞组织工程吊带的理想支架材料。本研究将BMSCs体外分离、培养及扩增后种植在UBM上，构建组织工程吊带，并对其生物学性状进行研究，并将其植入SD大鼠尿道附近，检测其生物力学性能，及吊带周围组织SMC含量的变化，以明确在体内尿道周围环境下BMSCs可否向SMC分化。本实验有望为构建新型生物材料吊带奠定理论基础，并为SUI的治疗提供新的策略。方法1. UBM及种子细胞的制备1.1UBM的制备采用机械和化学脱细胞法对家猪的膀胱进行脱细胞处理后，进行冻干、γ射线消毒，塑料封装，构建UBM材料。1.2BMSCs的分离、培养及鉴定采用密度梯度离心法体外分离、培养及扩增雄性SD大鼠的BMSCs，流式细胞术检测BMSCs免疫表型进行鉴定，将其作为组织工程吊带的种子细胞。2.组织工程吊带的构建及体外生物力学性能研究2.1组织工程吊带的构建及形态学观察将第3代BMSCs及平滑肌细胞经GFP转染后，分别与UBM复合培养，构建负载BMSCs及SMC的组织工程吊带，共培养7d后通过光、电镜观察细胞在材料上的生长状态。2.2组织工程吊带的体外机械性能检测应用万能力学测试仪检测所构建两种组织工程吊带的的最大负荷(KN)、杨氏模量(MPa)和伸展性(mm)等生物力学指标，以单纯UBM和聚丙烯材料的相同检测做对照。采用SPSS18.0统计软件包分析数据，计量资料以x±s表示，多组间差异行单因素方差分析。3.负载BMSCs的组织工程吊带体内生物力学性能及分化能力研究3.1负载BMSCs的组织工程吊带在动物体内的实验实验分为4组，每组15只大鼠，分别植入UBM、接种BMSCs的UBM、聚丙烯补片、假手术组。于术后1、2、4、8、12周分别取材，植入材料行机械性能检测，取尿道周围组织在基因(RT-PCR法)水平检测表达α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的含量。3.2免疫荧光观测体内BMSCs向SMC分化将转染腺病毒空载体的第3代雄性SD大鼠的BMSCs与UBM复合培养7d，植入SD大鼠体内，术后1、2周分别取材，Y染色体荧光定量PCR检测并制作标准曲线来检测负载细胞的存活数量。采用免疫荧光观测表达SMC特异标志蛋白α-SMA、calponin、SM-MHC的情况。结果1. UBM及种子细胞的制备1.1UBM的制备本实验制备的UBM为半透明的膜状组织，扫描电镜下UBM的胶原大体分布较平滑，纹理细腻且致密，脱细胞彻底。透射电镜下UBM胶原纤维排列整齐、致密。1.2BMSCs的分离、培养及鉴定原代分离的雄性SD大鼠BMSC呈多克隆生长，细胞呈梭形，折光性好，培养5～7d后传代，传代后30min开始贴壁。第3代BMSCs分布较均匀，形态较均一，增殖旺盛。特异性荧光抗体标记结合流式细胞仪检测发现，BMSCs稳定表达中胚层来源细胞CD29标志，阳性率95.3%，不表达造血细胞表型CD45标志及内皮细胞的特征性表型CD31标志，阳性率分别为1.52%及1.27%，符合干细胞表面标志特征。2.组织工程吊带的构建及体外生物力学性能研究2.1组织工程吊带的构建及形态学观察第3代BMSCs经GFP转染2d后，在倒置荧光显微镜下观察转染成功。将转染GFP的BMSCs与UBM复合培养7d后，在倒置荧光显微镜下观察发现，BMSCs在UBM上呈梭形排列，生长良好，扫描电镜下可见BMSCs牢固附着于UBM生长，大多数细胞的突起相互连接。UBM负载转染GFP的SMC，共培养7d后，倒置荧光显微镜下观察发现，SMC在UBM上附着良好生长。2.2组织工程吊带体外机械性能检测单纯UBM和复合BMSCs的UBM与SMC吊带和聚丙烯材料相比，最大负荷下降[(0.025±0.00303、0.0183±0.00397) KN vs (0.0304±0.00329、0.1428±0.03414) KN,P<0.01]；杨氏模量下降[(170.82±61.73531、103.624±52.77947) MPa vs(490.73±80.96864、900.1±192.40187) MPa, P<0.01]而伸展性提高[(16.418±1.01427、22.684±6.84766) mm vs (9.4978±1.38439、2.975±0.40127) mm, P<0.01]。3.负载BMSCs的组织工程吊带体内生物力学性能及分化能力研究3.1负载BMSCs的组织工程吊带体内实验大体观察发现UBM组及UBM+BMSCs组第1周植入组织轻微淡黄，炎症反应明显，但第2周开始明显减轻，到第4周仅有轻微反应，到第8周已无任何反应，至第12周UBM组及UBM+BMSCs组植入的材料已降解，而聚丙烯与组织镶嵌长在一起，且聚丙烯组强烈的炎症反应伴随整个实验阶段。炎症反应由低到高排序为：UBM+BMSCs组<UBM组<聚丙烯组。植入材料机械性能检测看出：各组材料的生物力学性能均在4周或8周开始下降，聚丙烯材料下降的幅度最大，但最大负荷仍明显高于UBM+BMSCs及UBM。负载BMSCs的UBM之前均较UBM稍好，但下降较UBM早。植入材料周围组织在基因(RT-PCR法)水平检测表达α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的含量，得出SMC基本呈逐渐增加趋势。3.2免疫荧光观测体内BMSCs向SMC分化含绿色荧光标记的雄性大鼠的BMSCs与UBM复合培养7d，植入SD大鼠体内1、2周后取材，荧光定量PCR检测Y染色体含量并制作标准曲线得出：负载BMSCs的组织工程吊带植入体内1周后Y染色体含量2.624015%，吊带上负载的BMSCs存活数量多，状态好；2周后Y染色体含量0.936067%，吊带上负载的BMSCs存活数量明显降低。免疫荧光观测负载BMSCs的组织工程吊带在体内1周及2周后的标本，可见BMSCs大部分表达了SMC特异标志蛋白α-SMA、calponin及SM-MHC。提示BMSCs可向SMC分化。结论1.本实验成功制备了UBM并分离到纯度好的BMSCs；2.成功构建分别负载BMSCs及SMC的UBM组织工程吊带材料；3.构建的两种组织工程吊带与聚丙烯材料相比：最大负荷、杨氏模量下降而伸展性上升。UBM负载SMC的杨氏模量及最大负荷较UBM负载BMSCs及单纯的UBM明显提高；4.动物体内实验表明了负载BMSCs的组织工程吊带的炎症反应较轻，生物相容性好、机械性能在8周前无明显减低；其周围的平滑肌细胞含量逐渐增加；5.证明了在体内尿道周围环境，组织工程吊带上负载的BMSCs存活数量多，状态好，并可向SMC分化。