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核糖体基因非转录间隔区(ribosomal gene nontranscribed spacer,NTS)能促进基因表达水平和延长基因表达时间。本研究以绿色荧光蛋白(GFP)和NEO基因为报告基因,构建含小鼠NTS370bp序列的系列表达载体,根据报告基因表达情况来验证NTS序列在不同动物细胞中的外源基因表达促进作用。首先将NTS序列插入pEGFP-N1真核表达载体,获得重组载体pEGFP-N1-NTS。然后在相同的条件下,分别用NTS载体和对照载体转染PK-15细胞、NIH-3T3细胞和293T细胞。荧光显微镜观察结果显示,pEGFP-N1-NTS转染组的荧光阳性细胞数和荧光强度明显高于pEGFP-N1转染组,表明小鼠NTS序列可促进外源基因在不同来源细胞中的瞬时表达。
PB转座子系统足较新的基因导入系统。为了进一步提高其基因导入效率,本研究先将小鼠NTS370bp序列插入PB转座子载体pAAAV-PBTR-EGFP中,获得新载体pAAAV-PBTR-EGFP-NTS。然后分别用两种转座子质粒单独或与PB转座酶表达载体pAAAV-PBase共转染不同来源的细胞系。荧光显微镜观察结果显示,pAAAV-PBTR-EGFP-NTS转染组的荧光阳性细胞数及荧光强度高于pAAAV-PBTR-EGFP转染组,pAAAV-PBTR-EGFP-NTS+pAAAV-PBase转染组的荧光阳性细胞数显著高于pAAAV-PBTR-EGFP+pAAAV-PBase转染组,表明小鼠NTS序列能以转座酶依赖和非依赖方式,促进转座子介导的外源基因在不同来源细胞中的表达。
将小鼠NTS370bp序列插入表达NEO基因的转座子载体pAAAV-PBTR-NEO中,获得新的表达载体pAAAV-PBTR-NEO-NTS。然后用两种质粒单独或PB转座酶表达载体pAAAV-PBase共转染不同来源的细胞系,经适当浓度G418筛选两周后,pAAAV-PBTR-NEO-NTS转染组的抗性细胞克隆数多于pAAAV-PBTR-NEO转染组,但差异不显著,而pAAAV-PBTR-NEO-NTS+pAAAV-PBase转染组的抗性细胞集落数显著多于pAAAV-PBTR-NEO+pAAAV-PBase转染组,说明小鼠NTS序列能协同PB转座子介导的外源基因在不同来源细胞细胞中的稳定表达。