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本研究旨在探索一种以化学试剂诱导去核卵母细胞为核受体胞质、利用电融合法诱导供体细胞与去核卵母细胞融合的手工核移植方法,从而降低显微操作核移植所需仪器的高成本、高技术要求,有利于核移植的进一步研究与推广。
本研究用脱羧秋水仙碱(Deme)诱导处理乙醇激活后的小鼠MⅡ卵母细胞,结果表明在Deme的作用下卵母细胞中的所有染色体随着极体的排放进入第二极体内。与极体成功分离的受体胞质经PHA处理后能与小鼠胎儿成纤维细胞粘连形成复合体,复合体电击后能成功融合得到重组胚。在优化无透明带胚胎体外培养系统的基础上,重组胚体外培养能开始胚胎的早期发育,从而初步建立起本实验室化学诱导去核与HMC结合的核移植方法。结果如下:
1.7%乙醇激活处理小鼠MⅡ卵母细胞后,小鼠卵母细胞从中期进入后期,卵母细胞膜上形成突起并排出第二极体。无透明带卵母细胞与有透明带卵母细胞乙醇激活率无差异,但第二极体成功排出率与有透明带卵母细胞相比有很大的提高。
2.Deme诱导处理乙醇激活后的小鼠卵母细胞,发现细胞中的所有染色体随着极体的排放进入到第二极体内,Deme诱导后卵母细胞去核表现出不同的类型。为提高去核率,本研究用不同浓度的Deme(0μg/mL,0.4μg/mL,0.5μg/mL,0.6μg/mL)分组处理有透明带的卵母细胞与无透明带的卵母细胞,结果表明:本实验室条件下,0.4μg/mL为化学诱导无透明带卵母细胞去核条件的最适条件。
3.挑选成功排出第二极体的无透明带卵母细胞,用玻璃微管反复吹打使第二极体与卵母细胞分离从而得到所需要的完全去核的受体胞质。
4.受体胞质经PHA(植物血球凝聚集素)处理后,能与小鼠胎儿成纤维细胞粘连形成供体细胞—受体胞质复合体。
5.供体细胞—受体胞质电击后能成功融合形成重组胚。本实验室条件下,电脉冲强度为100V/mm,脉冲时间为15μs,间隔ls连续两次的直流脉冲为较理想的电融合参数。
6.本研究建立并优化无透明带胚胎微滴体外培养系统,结果表明经Deme处理后的小鼠无透明带卵母细胞孤雌激活能成功发育到囊胚。
7.采用化学诱导去核和手工核移植方法构建的重组胚,在体外可发育形成4—细胞期,卵裂球可出现致密化但未能发育形成的囊胚。本实验室所建立的化学诱导去核与HMC结合的核移植方法还需要进一步完善。