大肠癌（colorectal cancer,CRC）是常见的消化道恶性肿瘤,目前临床上治疗中晚期大肠癌仍以化疗作为辅助手术治疗的主要手段,但由于肿瘤多药耐药的发生,常常会影响化疗疗效,因此寻找化疗药物的耐药靶点是提高大肠癌临床治疗效果的关键。多药耐药是指肿瘤细胞不仅对一种药物产生耐药性,而且对作用机制和化学分子结构均不同的其他药物也产生交叉耐药。肿瘤产生多药耐药的重要原因之一是由于多药耐药基因1（multidrug resistance 1 gene,MDR1）编码的P-糖蛋白（P-glycoprotein,P-gp）的过度表达,P-gp是三磷酸腺苷结合盒式（ATP-binding cassette,ABC）结构转运蛋白超家族中的一员,可以利用ATP水解释放的能量,在化疗药物尚未发挥细胞毒性作用时就将其泵出到细胞外,从而导致肿瘤细胞产生耐药性。大量研究发现,Wnt/β-catenin信号通路的异常激活可参与调节多种肿瘤的多药耐药,并且发现Wnt/β-catenin信号通路可以通过调控P-gp的表达从而影响肿瘤的多药耐药。micro RNA是一类非编码小分子单链RNA,可以调控靶基因的表达。其中miR-15a-5p是miR-15家族的成员,近年来研究表明其可以通过靶向结合多种编码基因m RNA的3’UTR,抑制靶m RNA的翻译或促进靶m RNA的降解,对基因进行转录后调控。但目前关于miR-15a-5p在大肠癌中的表达情况及与大肠癌多药耐药的关系鲜见报道。本研究旨在探讨miR-15a-5p在大肠癌中的表达情况以及在大肠癌多药耐药中的作用机制。目的:在组织水平检测miR-15a-5p与P-gp在大肠癌组织中的表达情况并分析二者的相关性。在细胞水平研究miR-15a-5p对Wnt/β-catenin信号通路中的关键蛋白Wnt3a、β-catenin及P-gp表达的影响,探讨miR-15a-5p在大肠癌多药耐药中的调节作用及机制。方法:1.通过实时荧光定量PCR法检测miR-15a-5p和MDR1 m RNA在大肠癌组织和癌旁正常肠黏膜组织中的表达情况,并分析miR-15a-5p和MDR1 m RNA在大肠癌组织中表达的相关性。2.通过实时荧光定量PCR法检测miR-15a-5p在大肠癌细胞HCT-116及大肠癌耐药细胞HCT-116/LOHP细胞中表达情况。3.通过Western blot实验检测Wnt3a、β-catenin、P-gp在大肠癌细胞HCT-116及大肠癌耐药细胞HCT-116/LOHP细胞中表达情况。4.通过细胞转染,将HCT-116/LOHP细胞分为五组:空白对照组、转染miR-15a-5p mimics NC的对照组、转染miR-15a-5p mimics的实验组、转染miR-15a-5p inhibitor NC的对照组、转染miR-15a-5p inhibitor的实验组,通过实时荧光定量PCR法检测miR-15a-5p的表达,MTT实验检测各组细胞在不同浓度奥沙利铂下的增殖情况并计算其生长抑制率、半数抑制浓度(IC₅₀)以及耐药指数（RI）。5.通过实时荧光定量PCR法检测转染后各组Wnt3a、β-catenin、MDR1m RNA的表达情况,通过Western blot实验检测转染后各组Wnt3a、β-catenin、P-gp的表达情况。结果1组织水平1.1 miR-15a-5p及MDR1 m RNA在大肠癌组织与癌旁正常肠黏膜组织的表达情况miR-15a-5p在大肠癌组织中的表达量为0.51（0.25）,明显低于癌旁正常肠黏膜组织1.17（2.95）。MDR1 m RNA在大肠癌组织中的表达量为2.21（4.07）,明显高于癌旁正常肠黏膜组织1.13（2.28）,（P均<0.05）。1.2大肠癌组织中miR-15a-5p表达与MDR1 m RNA表达的相关性Spearman相关分析显示,大肠癌组织miR-15a-5p表达与MDR1m RNA表达呈负相关关系（r=-0.343,P<0.05）。2细胞水平2.1 MTT实验验证HCT-116/LOHP细胞对奥沙利铂的耐药奥沙利铂对HCT-116细胞和HCT-116/LOHP细胞的半数抑制浓度(IC₅₀)分别为（13.51±2.62）μg/ml和（103.08±12.29）μg/ml（P<0.01）,计算得出耐药指数RI为7.63。2.2实时荧光定量PCR检测miR-15a-5p在HCT-116细胞和HCT-116/L-OHP细胞中的相对表达量分别为1.00±0.00和0.16±0.05,差异有统计学意义（P<0.01）。2.3 Western blot实验检测HCT-116/LOHP细胞中Wnt3a、β-catenin及P-gp的相对表达量均高于HCT-116细胞,差异有统计学意义（P<0.05）。2.4实时荧光定量PCR检测转染后各组miR-15a-5p的表达情况,空白对照组、转染miR-15a-5p mimics NC的对照组、转染miR-15a-5p mimics的实验组、转染miR-15a-5p inhibitor NC的对照组、转染miR-15a-5p inhibitor的实验组中miR-15a-5p的相对表达量分别为1.00±0.00、1.08±0.10、277.01±20.81、1.07±0.12和0.38±0.04。转染miR-15a-5p mimics组HCT-116/LOHP细胞中miR-15a-5p的相对表达量明显升高（F=527.82,P<0.001）,转染miR-15a-5p inhibitor组HCT-116/LOHP细胞中miR-15a-5p的相对表达量明显下降（F=79.93,P<0.001）。2.5 MTT实验检测转染后各组细胞对奥沙利铂的耐药情况,奥沙利铂对miR-15a-5p mimics NC对照组的半数抑制浓度(IC₅₀)为（100.35±10.57）μg/ml,miR-15a-5p mimics实验组为（40.78±2.47）μg/ml,差异有统计学意义（P<0.01）。奥沙利铂对miR-15a-5p inhibitor NC对照组半数抑制浓度(IC₅₀)为（102.08±5.95）μg/ml,miR-15a-5p inhibitor实验组为（132.77±7.97）μg/ml,差异有统计学意义（P<0.01）。奥沙利铂对空白对照组的半数抑制浓度(IC₅₀)为（99.98±2.63）μg/ml,空白对照组与阴性对照组HCT-116/LOHP细胞的差异均无统计学意义（P均>0.05）。2.6通过Western blot实验发现,HCT-116/LOHP细胞转染miR-15a-5p mimics实验组与转染miR-15a-5p mimics NC对照组相比Wnt3a、β-catenin与P-gp表达均降低（P<0.05）,空白对照组与转染miR-15a-5p mimics NC对照组相比Wnt3a、β-catenin与P-gp表达均无明显变化（P>0.05）。2.7通过Western blot实验发现,HCT-116/LOHP细胞转染miR-15a-5p inhibitor实验组与转染miR-15a-5p inhibitor NC对照组相比Wnt3a、β-catenin与P-gp表达均升高（P<0.05）,空白对照组与转染miR-15a-5p inhibitor NC对照组相比Wnt3a、β-catenin与P-gp表达均无明显变化（P>0.05）。2.8实时荧光定量PCR法检测结果显示HCT-116/LOHP细胞转染miR-15a-5p mimics实验组与转染miR-15a-5p mimics NC对照组相比Wnt3a、β-catenin与MDR1m RNA表达均降低（P<0.05）,空白对照组与转染miR-15a-5p mimics NC对照组相比Wnt3a、β-catenin与MDR1m RNA表达均无明显变化（P>0.05）。2.9实时荧光定量PCR法检测结果显示HCT-116/LOHP细胞转染miR-15a-5p inhibitor实验组与转染miR-15a-5p inhibitor NC对照组相比Wnt3a、β-catenin与MDR1m RNA表达均升高（P<0.05）,空白对照组与转染miR-15a-5p inhibitor NC对照组相比Wnt3a、β-catenin与MDR1m RNA表达均无明显变化（P>0.05）。结论:1.miR-15a-5p在大肠癌组织中低表达,MDR1在大肠癌组织中高表达,并在组织水平证明二者表达呈负相关关系。2.miR-15a-5p在大肠癌耐药细胞HCT-116/LOHP中的表达水平明显低于敏感细胞HCT-116,Wnt3a、β-catenin及P-gp在大肠癌耐药细胞HCT-116/LOHP细胞中表达水平明显高于敏感细胞HCT-116细胞,miR-15a-5p及Wnt/β-catenin信号通路在大肠癌多药耐药的形成中发挥重要作用。3.上调miR-15a-5p表达可显著提高大肠癌耐药细胞HCT-116/LOHP对化疗药物的敏感性,而下调miR-15a-5p表达可显著降低大肠癌耐药细胞HCT-116/LOHP对化疗药物的敏感性,表明miR-15a-5p参与调控大肠癌多药耐药。4.上调miR-15a-5p表达能显著抑制Wnt/β-catenin信号通路的关键蛋白表达,如Wnt3a、β-catenin及其下游P-gp的表达,而下调miR-15a-5p表达则显著增加Wnt3a、β-catenin及P-gp的表达,miR-15a-5p通过影响Wnt/β-catenin通路的活性,介导转运蛋白P-gp的表达从而参与调控大肠癌多药耐药。