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椎间盘突出症是由椎间盘退变(intervertebral disc degeneration,IVDD)引起的间盘突出、椎管狭窄,进一步导致的盘源性腰痛及神经根受损的症状,它的病理学基础是椎间盘退变。目前临床针对椎间盘退行性疾病的治疗通常包括保守治疗及手术治疗,治疗效果尚可。然而对于无症状性椎间盘退变的防治,尚无明确的定论及具体的防治措施。因此探索椎间盘退变的分子学机制以及如何减缓其进展是目前研究的热点。众所周知,炎症在IVDD的病理学中起着关键作用。炎症因子大致通过三个阶段作用于椎间盘退变过程中,包括:诱导椎间盘细胞的过度表达,从而引起间盘结构的破坏及不稳定;募集免疫细胞,引起并扩大级联反应;产生引起疼痛相关的离子通道等最终引起下腰痛及神经根受损症状。TNF-α作为参与IVDD的重要炎症因子,不仅与椎间盘退变密切相关,而且还被认为是该疾病的主要原因。微小RNA(miRNA)是一组内源性表达、小的非编码的RNA,它可以抑制基因表达通过靶信使RNA作用翻译表达和/或分裂。据估计尽管miRNA总数仅仅达人基因组的1%-3%,但它可以调节近30%人类蛋白编码基因。已有相当的大量证据暗示它与许多生物学调控相关,包括细胞增殖、谱系测定、凋亡、细胞因子释放及细胞基质合成和代谢。miRNA的失调已经被证实参与了很多疾病的发生和发展过程,包括大量癌症,退变性疾病,和心血管疾病。也有研究证实miRNA介导的转录后调控机制可影响IVDD进程。生物信息学分析miRNA-502可能在人椎间盘髓核细胞凋亡中起着潜在的作用。本研究通过对比miRNA-502及TNF-α在正常和退变IVD组织中差异表达,观察miRNA-502及TNF-α在IVDD发展过程中的关系。建立TNF-α诱导髓核细胞凋亡的模型,预测其靶基因,阐明miRNA-502及其靶基因在IVDD中的作用及分子机制,以为IVDD早期诊断提供敏感、特异的新型分子诊断标志物,为临床上从基因水平诊断及防治IVDD提供新途径及科学依据。第一部分人体椎间盘髓核组织中miRNA-502及TNF-α表达量的研究目的:本研究通过分析miRNA-502及TNF-α在正常及IVDD髓核组织中的差异性表达,探讨miRNA-502及TNF-α在IVDD中的关系。方法:收集河北医科大学第三医院5例IVDD病人髓核标本及5例年青脊柱爆裂骨折患者正常髓核标本,通过实时定量PCR技术测定两组样本miRNA-502基因的表达水平,通过免疫荧光染色技术检测两组样本TNF-α水平。所有实验数据资料我们均采用SPSS20.0统计学软件来进行分析处理,本实验中的数据资料均以均数土标准差(X±s)的形式来表示。在本实验中,两组间的比较采用的是两个独立样本t检验方法,多组别间的比较采用的是单因素方差分析方法,如果P<0.05表示具有统计学差异。结果:人退变的髓核组织较正常椎间盘组织中miRNA-502的表达水平明显增高,且TNF-α的表达明显升高,其差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:miRNA-502及TNF-α均表达于正常的椎间盘NP组织和退变的椎间盘NP组织中;但在退变NP组织中miRNA-502及TNF-α高表达说明两者与椎间盘的退变有密切的联系。第二部分体外TNF-α诱导NP细胞凋亡中miRNA的表达差异及miRNA-502对人髓核细胞凋亡的影响目的:体外建立TNF-α诱导人NP细胞凋亡模型,通过基因芯片分析凋亡NP细胞中miRNA的差异表达,miRNA-502在NP细胞凋亡中的表达意义,NF-κB(p-p65)活性在miRNA-502作用下的表达。方法:1.体外培养人椎间盘NP细胞株,应用同浓度TNF-α(100ng/ml)刺激髓核细胞,在6h收集正常对照及退变NP细胞(TNF-α刺激24h)裂解后做miRNA基因芯片分析,分析不同miRNA在TNF-α诱导人髓核细胞凋亡中的表达差异性。2.验证miRNA-502 mimic及miRNA-502 inhibitor对miRNA-502表达水平的影响。体外培养人椎间盘NP细胞株,分别转染入miRNA-502 mimic及miRNA-502 inhibitor,总共分为以下3组将miRNA-502 mimic组、miRNA-502 inhibitor组、control组,q RT-PCR检测miRNA-502的表达水平。3.将NP细胞在TNF-α环境下诱导凋亡,分别转染入miRNA-502 mimic及miRNA-502 inhibitor,总共分为以下4组:TNF-α组,TNF-α+miRNA-502mimic组,TNF-α+miRNA-502 inhibitor组,control组。应用DAPI/TUNEL荧光染色检测NP细胞凋亡,运用免疫蛋白印迹技术(Western-blotting)检测凋亡相关蛋白caspase-3及caspase-7表达水平,ELISA法检测NF-κB(p-p65)蛋白活性。4.统计学方法同第一部分。结果:1.基因芯片分析检测分析筛选退变的NP细胞中差异表达miRNA中共筛选出27个,其中表达上调14个(miRNA-502、miRNA-224、miRNA-3572等),下调13个(miRNA-203、miRNA-146、miRNA-346等),其中上调基因中miRNA-502差异表达明显。2.miRNA-502 inhibitor组miRNA-502表达水平较对照组显著降低,而miRNA-502 mimic组则相反(P<0.05)。3.TUNEL实验结果显示:TNF-α可使人NP细胞凋亡增加,与TNF-α组相比TNF-α+miRNA-502 inhibitor组人NP细胞凋亡明显增高,与TNF-α+miRNA-502 mimic组相反(P<0.05);Western blot检测与凋亡相关的蛋白表达,实验结果显示:TNF-α干预可促进人NP细胞caspase-3/7表达,而TNF-α+miRNA-502 mimic组caspase-3/7表达较TNF-α组减低,TNF-α+miRNA-502 inhibitor组caspase-3/7表达较TNF-α组明显增高(P<0.05)。ELISA法检测结果显示:TNF-α组NF-κB(p-p65)蛋白活性增高,而TNF-α+miRNA-502 inhibitor组NF-κB(p-p65)蛋白活性表达较TNF-α组明显减低,TNF-α+miRNA-502 mimic组NF-κB(p-p65)蛋白活性明显增高(P<0.05)。结论:1.TNF-α可以诱导髓核细胞凋亡。2.在退变NP细胞中miRNA-502表达明显增高,提示可能参与了IVDD的发病过程。3.miRNA-502过表达会抑制TNF-α诱导髓核细胞凋亡。4.NF-κB活性表达变化与miRNA-502表达变化一致,提示NF-κB(p-p65)可能参与到了miRNA-502对TNF-α诱导人髓核细胞凋亡的作用机制中。第三部分miRNA-502在IVDD中靶基因预测、验证及作用机制研究目的:预测miRNA-502在凋亡过程中的靶基因,研究miRNA-502、NF-κB、TNF-α三者在NP细胞凋亡中的相关性及作用机制,为探讨miRNA-502在IVDD过程中的分子生物学机制及可能性的治疗手段提供可靠的依据。方法:选择人髓核细胞株放置在DMEM培养基中,并在温育箱中进行培养。1.将NP细胞根据本实验要求因素的不同,转染NF-κB抑制剂(BAY11-7082),总共分为以下4组:TNF-α组;BAY 11-7082组;TNF-α+BAY11-7082组;control组。DAPI/TUNEL检测观察细胞核凋亡情况;免疫蛋白印迹技术(Western-blotting)检测Caspase 3/7活性明确细胞凋亡程度。2.应用DIANA生物信息学分析软件,预测miRNA-502在NP细胞凋亡中的靶基因。由上海吉玛公司构建野生型及突变型靶基因质粒,双荧光素酶测定靶基因活性变化。3.验证靶基因与NF-κB(p-p65)在NP细胞凋亡中的相关性,通过对比靶基因与突变型靶基因的表达水平证实其有效性,通过转染靶基因干扰RNA,明确其作用机制。4.统计学方法同第一部分。结果:1.通过TUNEL检测观察细胞核凋亡情况,发现TNF-α+BAY 11-7082组细胞核凋亡数目较其它3组明显增高;Western-blotting检测Caspase 3/7活性发现,TNF-α组Caspase 3/7活性增高,而TNF-α+BAY 11-7082组增高趋势更加显著,以上结果表明TNF-α不仅可促进髓核细胞凋亡,还可一定程度上激活NF-κB,而抑制NF-κB(BAY 11-7082)又可增加TNF-α诱导的凋亡。进一步说明NF-κB的激活可在TNF-α诱导细胞凋亡中发挥负向调节作用。2.应用DIANA生物信息学分析软件,预测miRNA-502在NP细胞凋亡中的靶基因为TRAF2。进一步验证靶基因:2.1双荧光素酶报告基因分析结果显示,48h后:Wt TRAF2 3’-UTR+miRNA-502实验组荧光素酶的表达水平下调明显(P<0.05),其它三组无明显变化趋势(P>0.05),此结果以显示野生型TRAF2在miRNA-502作用下出现了显著的变化,而突变型TRAF2未出现变化。2.2 miRNA-502 mimic组中TRAF2的m RNA及蛋白水平的表达较对照组均明显降低(P<0.05)。3.TRAF2与NF-κB(p-p65)在NP细胞凋亡中的相关性1)体外培养人椎间盘NP细胞株,通过转染TRAF2 si RNA,将实验组分为两组,control组、si RNA组。通过q RT-PCR结果比较了两组的TRAF2的m RNA水平的表达。结果显示si RNA组m RNA水平较对照组明显降低(P<0.05)。此实验说明si RNA具有明显抑制TRAF2表达的作用。2)体外培养人椎间盘NP细胞株,在TNF-α诱导细胞凋亡的作用下,通过转染si RNA,将实验分为三组:control组、TNF-α组、TNF-α+si RNA组,ELISA法检测NF-κB活性。结果显示:TNF-α组NF-κB活性较对照组升高,而TNF-α+si RNA组NF-κB活性增加程度更为明显(P<0.05)。结论:1.TNF-α不仅可促进髓核细胞凋亡,还可一定程度上激活NF-κB,而抑制NF-κB(BAY 11-7082)又可增加TNF-α诱导的凋亡。2.NF-κB的激活可在TNF-α诱导细胞凋亡中发挥负向调节作用。3.TRAF2是miRNAs-502在NP细胞凋亡中的靶基因,miRNAs-502对TRAF2存在靶向抑制作用,TRAF2对NF-κB的活性表达有抑制作用。4.miRNA-502通过其靶基因TRAF2激活/抑制NF-κB,从而于TNF-α诱导的细胞凋亡中起保护作用。