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豆科植物与根瘤菌共生形成一个特殊的器官-根瘤,根瘤是根瘤菌共生固氮的场所,其形成和发育都是根瘤菌与宿主植物相互作用的结果。在豆科植物中,存在两种不同形态的根瘤:即定型根瘤和不定型根瘤。定型根瘤的分生组织活性周期短,且根瘤各个组织的发育阶段一致;不定型根瘤的分生组织活性延续时间长,根瘤菌则持续感染其分生组织,导致根瘤有明确的分生区、侵染区、固氮区和衰老区,各个区域处于不同的发育阶段。模式豆科植物蒺藜苜蓿根瘤属于不定型根瘤,其共生伙伴-苜蓿中华根瘤菌在侵染区与固氮区间开始分化成类菌体并行使固氮功能。为了揭示根瘤菌在根瘤中侵染、存活、定殖分化及固氮的机制,本研究以中华苜蓿根瘤菌Sm2011菌株为材料,开展了共生固氮相关基因突变体分离和鉴定的工作,主要研究结果如下:1.构建了苜蓿中华根瘤菌Sm2011菌株的突变体库:利用三亲本杂交技术,以Sm2011为受体,以E.coli S17-1/pMH1701为供体、E.coli/pRK2073作为辅助菌进行三亲本杂交。其结果表明,Tn5-sacB转座频率为1.84×10-6,经Km抗性、蔗糖敏感及Tc抗性筛选,分离得到约8000株根瘤菌Tn5-sacB插入突变体。随机挑选23个单菌落,通过PCR证实Tn5-sacB插入在根瘤菌基因组。2.筛选根瘤菌抑制苜蓿根瘤免疫相关基因的突变体:蒺藜苜蓿抑制根瘤免疫基因突变体（nad1）,在接种野生型根瘤菌时,形成不能固氮根瘤（白色）。利用该突变体的根瘤表型,接种Tn5-sacB插入突变的根瘤菌,尝试筛选出能形成粉红色的根瘤。结瘤实验结果表明,在约1600棵nad1缺陷型植株中,未发现有结粉红色根瘤的植株。说明利用该方法难以筛选到根瘤菌恢复nad1突变体结固氮根瘤的表型。3.苜蓿根瘤菌共生固氮相关基因突变体的分离和鉴定:利用巢式PCR检测技术,从约8000株根瘤菌Tn5-sacB插入突变体库中鉴定和筛选出4个特定目标基因的插入位点及其突变体,即固氮酶基因nifH-75-9,结瘤基因nodC-32-33,肽聚糖相关基因smc04024-76-79和smc01188-11-80,其中只有smc04024的插入位点位于基因F端上游,其他三个突变体中Tn5均插入在基因序列中。通过结瘤实验,考察突变体共生及固氮表型,得到野生型苜蓿种子接种nifH基因突变体28 d后,形成不能固氮根瘤（白色）;接种nodC基因突变体10 d后,不能形成根瘤。该结果与已经报道的结果完全一致,证实了突变体库的完整性。而在接种smc01188基因突变体28 d后,所得到的根瘤虽然呈粉红色,但红色区域较野生型根瘤大大减少,且植株叶片背面呈红褐色,植株呈现一定程度的缺氮表型;接种smc04024基因突变体28 d后,植株根瘤及叶片与接种野生型根瘤菌相比基本相同,这说明该基因的插入位点未破坏该基因的正常表达。此举为鉴定苜蓿根瘤菌突变体提供资源及筛选程序,为后续深入研究根瘤菌共生固氮调节的分子机制提供科学资料。