论文部分内容阅读
目的:胃癌是对人类健康与生命危害最大的恶性肿瘤之一,目前胃癌临床治疗手段主要是根治性切除手术辅以术前、术后化疗及放射治疗。由于临床所见病例多为中晚期患者,手术及放、化疗效果差,长期生存率较低,因此,如何提高胃癌根治术后效果,改善胃癌晚期患者生活质量,预防胃癌复发及转移一直是临床长期探索的问题。肿瘤过继性细胞免疫治疗(adoptive cellular immunotherapy,ACI)是继手术、化疗和放疗之后的第四种肿瘤治疗模式。迄今,NK细胞、CTL、MΦ、TIL、LAK、CIK和DC细胞的过继治疗已在临床上得到应用,其中CIK和DC细胞为基础的抗肿瘤免疫治疗以其独特的优势,近年来成为国内外众多学者的研究热点。细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer cells,CIK)是由多种细胞因子如IL-2、IFN-γ和CD3单克隆抗体等诱导而成的对多种肿瘤具有杀伤活性的细胞毒性T细胞,其溶瘤活性具有非MHC限制性,是一种非特异性的免疫杀伤细胞。CIK细胞能分泌多种细胞因子(如IL-4、IFN-γ等),且具有比LAK、CD3AK细胞更强的杀伤活性。树突状细胞(dendritic cells,DC)是功能强大的主要的抗原递呈细胞,分布于除脑和睾丸以外身体各部的任何组织,DC借助膜表面不同受体可有效捕获低浓度抗原,并能与这些抗原表面的MHC I类和II类分子结合,刺激初始型CD8+T细胞和CD4+T细胞活化。综合国内外研究表明,将负载肿瘤抗原的DC细胞和具有高效杀伤活性的CIK细胞联合应用治疗恶性肿瘤,将有望起到协同作用。本研究将利用MTT法和流式细胞仪分别完成负载抗原的DC和CIK的联合培养物对MGC-803的杀伤活性和凋亡机制的初步研究,为DC和CIK联合治疗胃癌应用于临床打下科研基础。材料与方法:1 PBMC来源的CIK和DC细胞制备:提取人外周血单个核细胞(PBMC) ,在体外以基因重组人白介素-2(interleukine-2,IL-2)、鼠抗人CD3单抗(anti-CD3McAb)、基因重组人白介素-1α(interleukin-1α,IL-1α)、基因重组人干扰素-γ(interferon-γ,INF-γ)等细胞因子刺激非贴壁细胞获得成熟CIK;以基因重组人粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage CSF,GM-CSF)和基因重组人白介素-4(interleukine-4,IL-4)刺激贴壁细胞获得DC,并以流式细胞仪检测细胞表型。2 MGC-803胃癌细胞可溶性抗原制备及定量:以液氮反复冻融MGC-803细胞,过滤,制成用以刺激DC细胞的可溶性抗原,以考马斯亮蓝法对蛋白抗原进行定量测定。3不同效靶比和培养天数下,不同效应细胞组杀伤功能的比较:将效应细胞分作3组:单纯CIK组、未负载MGC-803抗原的DC+CIK组和负载MGC-803抗原的DC+CIK组,分别记做:CIK、DC-CIK和Ag-DC-CIK。效应细胞培养12d后,以MTT法测定CIK、DC-CIK和Ag-DC-CIK对MGC-803杀伤作用,效靶比分别为:2.5:1、5:1、10:1、20:1,并测定不同时间对其作用的影响。4酶联免疫吸附法检测外分泌细胞因子水平:提取培养6d、12d和21d的Ag-DC-CIK细胞上清液,检测细胞外分泌细胞因子IL-2、TNF-α、INF-γ含量随培养天数的变化。5 Ag-DC-CIK对MGC-803细胞增殖及凋亡的作用:将培养18d的效应细胞和靶细胞混合培养(E:T=20:1)24h后,收集细胞,加入Hoechst 33342至终浓度为1ug/ml,37℃孵育10min,离心,弃染液。加入PI染液重悬避光染色。流式细胞仪分析蓝色荧光对红色荧光的散点图或地形图。正常细胞为低蓝光/低红光,凋亡细胞为高蓝光/低红光,坏死细胞为低蓝光/高红光。结果:1单独培养的CIK细胞在第3d开始增殖,第5-6d进入快速增殖期,CIK细胞和DC(包括负载和未负载MGC-803抗原)共培养后的第12d开始,共培养细胞组的增殖速度开始明显增快,并快于同源CIK细胞(p<0. 05)。2健康成年PBMC在体外可以分别由IL-2、CD3McAb、IL-1α、INF-γ和GM-CSF、IL-4诱导出经表型鉴定为成熟的CIK和DC细胞。其中有(79.64±3.41)%的细胞表达成熟DC特异性表面标志CD83,(95.17±1.22)%的细胞表达HLA-DR,(94.66±2.42)%的细胞表达CD86,(86.59±1.09)%的细胞表达CD40。与DC共培养的CIK细胞在培养第14d时CD3+CD8+、CD3+CD56+双阳性细胞的百分含量进一步升高到59.39%-60.46%和35.67%-36.90%,经抗原刺激过的DC与CIK共培养14d后,混合细胞中CD3+CD8+、CD3+CD56+细胞最多,达到63.63%-65.42%和51.03%-53.15%,与CIK组和DC-CIK组相比均具有显著性差异(p<0.05)。3在2.5:1-20:1效靶比范围内,DC-CIK对MGC-803靶细胞的杀伤活性一般均高于同源CIK细胞,经MGC-803细胞冻融物致敏的Ag-DC-CIK共培养细胞对MGC-803靶细胞的杀伤活性有进一步的提高,与单纯CIK细胞组比较差异显著(p<0.05),与DC-CIK共培养细胞组比较也有显著性差异(p<0.05)。4 IFN-γ在21d的混合细胞上清液中表达较高,TNF-α在各个时期均能检测到,但表达水平变化很明显,在第6d时低表达,21d时较高。促炎因子IL-2变化正好与TNF-α相反,主要在第6d高表达,21d时表达相对较低或不表达。5 24h组凋亡早期、中期、晚期细胞及正常细胞在FCM散点图中占绝大多数比例,而48h组以坏死细胞为主,凋亡细胞已较24h明显减少。结论:1负载MGC-803胃癌细胞抗原的DC可使CIK的增殖速度进一步提高。2负载MGC-803抗原的DC与CIK共培养后可使具备攻击能力的主要细胞群CD3+CD8+、CD3+CD56+双阳性细胞群比例分别进一步提高。3经抗原冲击的DC与CIK共培养后能增强其对胃癌细胞MGC-803的杀伤活性。4 Ag-DC-CIK在体外培养过程中不仅需要持续来源于外界细胞因子的存在,而且该效应细胞组还能够向细胞外分泌IFN-γ、TNF-α、IL-2影响其自身的功能。5在效靶相互作用初期,Ag-DC-CIK对MGC-803的杀伤作用主要通过诱导肿瘤细胞凋亡,同时发生自身凋亡来实现;在相互作用的中晚期,细胞开始趋向坏死。