脑卒中是脑血液循环障碍引起的急性脑血管病,因为循环障碍的原因不同,可分为缺血性脑卒中(ischemic stroke)和出血性脑卒中(intracerebral hemorrhage,ICH)。缺血性脑卒中又叫脑梗死,约占全部卒中的80%。是由各种原因引起的局部脑组织供血障碍,导致缺血缺氧性的脑组织病变坏死,进而造成一系列的神经功能损伤的疾病。在缺血性脑卒中的病理发展过程中,有一种状态兼具缺血性脑卒中和出血性脑卒中的特征,即脑缺血出血转化(hemorrhagic transformation,HT),在脑缺血病人中,出血转化和升高的死亡率相关。缺血性脑卒中急性期的溶栓治疗是目前唯一经过美国FDA批准的治疗方法。最常用的溶栓药物是纤溶酶原激活剂(tissue-type plasminogen activator,t PA),其可有效改善患者的生存率和预后[1]。但由于其可增加出血性转化的发生率,以及在超过脑梗后4.5小时使用会极大地增加出血几率,溶栓治疗方法的使用受到诸多限制。因此,研发与t PA联合使用,以降低其导致的出血性转化,或可延长其使用时间窗的药物具有极大的临床应用潜力。脑出血是致命的卒中类型,有较高的发病率和死亡率[2],约占全部卒中的10~15%。有报道指出,脑出血发病后一月死亡率约为40%,过去二十年医疗水平的提高并不能降低该死亡率[3]。脑出血的高复发率和致死率的原因是由于缺乏有效的治疗选择,因为现有的临床治疗方法还仅限于初级治疗,如控制颅内压、治疗血肿和维持血流动力学稳定[2,4],因此研究有效的治疗方法极为重要。烟酰胺磷酸核糖转移酶,简称Nampt,是哺乳动物细胞内NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)合成的限速酶,可调控NAD的浓度。本课题组在小鼠脑缺血模型上的研究发现,Nampt可以通过控制NAD的合成来调控SIRT1的去乙酰化能力,进一步调节AMPK的上游激酶LKB1的乙酰化和细胞内的重分布,最终调节AMPK活性,发挥神经保护作用[5]。此外,我们还发现:Nampt酶产物烟酰胺单核苷酸,即NMN可以通过脑室给药在大鼠线栓法大脑中动脉堵塞模型(MCAO)中发挥神经保护作用,改善动物神经学功能。主要包括:脑梗体积缩小、神经功能缺陷减轻、半影区细胞死亡减少[6]。在线栓法MCAO再灌注小鼠模型上,NMN腹腔注射(500mg/Kg),每天1次,连续给药1周以上,可显著降低脑卒中死亡率,促进脑卒中后神经再生、功能恢复[7]。本课题利用不同的动物模型和更贴近临床的给药方法进一步验证了NMN在缺血性脑卒中中的作用。构建了脑梗出血转化模型和脑出血模型,并探索NMN在这两种模型中的作用和机制。实验方法一、在脑梗和脑梗出血转化模型研究中用到的方法1.利用电击凝断大脑中动脉,构建电凝法MCAO模型;2.栓线经颈内动脉入颅,堵塞大脑中动脉,构建线栓法MCAO模型;3.利用TTC染色,连续切片法计算脑梗死体积;4.在p MCAO模型中,梗死后5h给t PA,诱导脑梗出血转化;5.利用Quanti ChromTM Hemoglobin Assay Kit检测脑组织血红蛋白含量。二、在脑出血模型的研究中用到的方法1.利用脑立体定位技术,向纹状体注射0.05U胶原酶IV,诱导脑出血模型;2.利用平衡木实验,评价小鼠神经功能;3.利用连续切片法,计算血肿体积;4.利用Real-time PCR技术检测炎症因子m RNA水平;5.利用免疫组织化学染色的方法检测炎症因子、趋化因子和NOX1的表达,以及炎性细胞的活化;6.利用TUNEL染色技术检测细胞死亡情况;7.通过检测MDA、H2O2、Cu Zn/Mn-SOD和ABTS活性,评价氧化应激水平。研究结果1.NMN静脉给药可降低电凝法MCAO大鼠脑梗死体积。2.NMN预给药或急性期给药可降低线栓法MCAO小鼠脑梗死体积。3.NMN毒性测试显示其无明显的急性毒性。4.成功构建了脑梗出血转化模型。5.NMN静脉给药可减少脑梗后自发性出血转化和t PA诱导的出血转化。6.成功构建了胶原酶诱导的脑出血模型(c ICH)。7.NMN急性期静脉给药可改善脑出血后小鼠神经功能。8.NMN急性期静脉给药可缓解出血损伤诱导的脑组织水肿9.NMN急性期静脉给药可下调血肿及周围组织炎症因子(TNF-a、IL-6)和趋化因子(Icam-1)的表达。10.NMN急性期静脉给药可下调血肿及周围组织小胶质细胞的活化和中性粒细胞的浸润。11.NMN急性期静脉给药可减少血肿周围组织细胞死亡。12.NMN急性期静脉给药可降低血肿周围组织脂质氧化活性和过氧化氢活性,下调NOX1的表达。13.NMN长期给药可促进脑出血模型小鼠神经功能和体重的恢复。综上所述,本课题成功构建了脑梗出血转化和脑出血模型,并发现了NMN在缺血性脑卒中模型、脑梗出血转化模型和脑出血模型中的有益作用。