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背景和目的:结直肠癌(Colorectal Cancer, CRC)发病率占所有癌症中第四位,其死亡率占第二位。虽然结直肠癌患者目前可以得到以手术、化疗和放疗等多种手段的综合治疗,大约有40%的患者即使进行综合治疗后依然出现复发和转移,5年生存率仅50%左右。越来越多的证据表明,CRC的发展过程中肿瘤干细胞样细胞(Cancerstem-like cells,CSLCs)或者肿瘤干细胞(Cancer stem cells,CSCs)具有重要的作用,是促进肿瘤复发、侵袭、转移的关键因素。近年来,研究发现分化抑制因子1(Inhibitors of differentiation1,Id1)在多种癌症中高表达,包括乳腺癌、前列腺癌、肺癌、胃癌、食管癌和CRC,是新的肿瘤相关基因。Id1在其他癌症中被证明具有促进肿瘤生长、侵袭和转移的作用,同时具有维持胚胎干细胞和神经干细胞自我更新的功能。虽然,在CRC中,仅有少量的研究表明Id1具有促进早期血行转移和调节CSCs的自我更新的作用,但是,Id1对CRC肝转移以及肠癌CSCs相关特性的影响需要进一步验证,并且其中可能存在的机制值得进一步探讨。因此,本次研究,我们首先分析Id1和最常见的肠癌干细胞标志物CD133的表达之间关系,以明确Id1和CD133表达相关性及其临床意义;其次,采用慢病毒介导的RNA干扰基因水平抑制HCT116细胞Idl表达,观察Id1基因沉默后体外自我更新功能的变化,体内启动肿瘤生长能力的改变,并且探讨肠癌干细胞最重要的信号通路(Wnt/β-catenin通路)是否受到影响;最后,我们将探索沉默Idl基因对HCT116细胞体外上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)特性、侵袭转移和体内肝转移是否产生影响,并初步分析Id1介导侵袭转移的可能分子机制。材料和方法:1.采用Real-time荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测30例CRC病例新鲜组织中癌组织与正常大肠组织的Id1与CD133mRNA表达情况;采用免疫组织化学染色方法(Immunohistochemistry,IHC)检测75例CRC患者癌组织、20个正常大肠组织的中Id1与CD133蛋白表达情况,并分析它们与临床病理特征的关系。采用spearman相关分析Id1与CD133mRNA和蛋白表达的相关性。2.采用shId1和shcontrol(对照组)慢病毒感染HCT116细胞,构建Id1基因稳定沉默的细胞株模型。利用qRT-PCR和Western Blot检测Id1mRNA和蛋白表达,验证Id1沉默效应;MTS法和克隆形成实验检测细胞增殖情况;AnnexinV-PE/7-AAD检测细胞凋亡情况;qRT-PCR和Western blot检测细胞增殖、凋亡相关分子PCNA、Survivin的表达情况;利用体外无血清悬浮球培养方法检测体外细胞自我更新功能;qRT-PCR、Western blot、FACS检测CRC干细胞相关标志物表达;荧光素酶报告基因检测TCF/LEF启动子活性;构建BABL/C裸鼠皮下移植瘤模型,不同浓度梯度细胞接种后检测启动肿瘤能力。3.倒置显微镜观察稳定沉默Id1后HCT116细胞形态变化;划痕实验和Transwell小室模型检测细胞迁移和侵袭能力;qRT-PCR和Western blot检测细胞侵袭、EMT相关分子(MMPs、TIMPs、CXCR4、snail、twist和E-cadherin)的表达情况;构建BABL/C裸鼠脾脏移植瘤肝转移模型,分析Id1基因下调对肝转移影响。结果:1. Id1mRNA在结CRC中的表达量明显高于正常肠粘膜组织(0.391±0.095vs.0.21±0.039,p<0.05),CD133mRNA在CRC中的表达量也比正常肠粘膜组织高(0.207±0.036vs.0.105±0.028, p<0.05)),两者mRNA表达呈正相关关系(R=0.401,P=0.031)。IHC结果显示Id1在35例(46.7%)CRC癌组织具有高表达,表达与分化程度呈负相关,而20例正常大肠上皮中标本均表现为阴性表达。22例(29.3%)结直肠肠癌组织呈现CD133高表达,CD133表达与T分期呈正相关,正常肠粘膜中仅2例高表达,其余表现为阴性表达。Spearman相关分析发现,Id1蛋白的表达与CD133具有正相关性关系(R=0.319,P=0.005)。2.(1)HCT116细胞Id1基因沉默后,与对照组比较其细胞增殖活性明显下降、凋亡增加, PCNA和survivin的mRNA和蛋白水平也明显下调。HCT116细胞Id1基因沉默后,与对照组比较其细胞球大小和数量明显下降;干细胞标志物CD24、CD133、EZH2、EpCAM、OCT4和β-catenin的mRNA和蛋白表达均明显下降,但是CD44、CD166和Lgr5蛋白表达未见明显变化;Id1沉默的细胞株加入5-Fu后IC50是5.2±0.3μM,对照组细胞加入5-Fu的IC50是8.4±0.4μM,两者间差异具有统计学意义(p<0.05);细胞核和胞浆中β‐catenin在Id1沉默细胞株的表达量明显低于对照组,TCF/LEF启动子活性在Id1沉默细胞株明显低于对照组细胞株。Wnt/β‐catenin通路常见的下游分子CyclinD1和survivin的mRNA和蛋白水平也明显下降。(2)裸鼠皮下移植瘤试验证明Id1沉默的HCT116细胞形成的皮下移植瘤体积较对照组小(P<0.05);对照组1×105就可以启动小鼠肿瘤的生长,但是对于Id1基因沉默组要5×105细胞数才能启动肿瘤的生长,Id1沉默后HCT116细胞在体内启动肿瘤生长的能力较对照组下降了约5倍。3.(1)Id1沉默的HCT116细胞表现为上皮样形态,排列规则、细胞与细胞紧密连接、成团生长,EMT相关蛋白E-cadherin表达增高,而snail和twist则表达明显降低;HCT116细胞Id1基因沉默后,与对照组比较其迁移能力下降、穿过transwell小室的细胞数也明显下降;MMP2、MMP9、CXCR4mRNA和蛋白表达均下调,而TIMP1、TIMP2蛋白表达升高;HCT116细胞Id1稳定沉默后转染外源性CXCR4可以部分逆转因Id1下调导致的细胞迁移和侵袭能力的下降。(2)Id1下调的HCT116细胞接种到裸鼠脾脏后肝脏转移率为60%(6/10),而对照组100%形成肝脏转移灶(10/10),肝脏重量在Id1下调组明显轻于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:在CRC中,Id1的表达与干细胞标志CD133呈正相关。在CRC细胞中沉默Id1导致细胞自我更新功能下降,可能与下调Wnt/β-catenin途径有关。体外Id1沉默可逆转CRC细胞EMT过程、降低CRC侵袭能力,在体内可抑制CRC细胞肝转移,其中可能是通过Id1/CXCR4信号轴实现。