【摘 要】
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扩展青霉脂肪酶（Penicillium expansum Lipase,PEL）在催化三脂酰甘油酯时几乎没有位置选择性。利用YASARA View对PEL的三维结构（PDB:3G7N）进行分析发现,在其底物结合口袋上方有一个指向"盖子"的柔性环状突出（位于整体结构的C端）,该柔性结构上具有与酶催化活性密切相关的疏水性氨基酸237V。通过三级结构比对,我们发现PEL分子中这个C端的环状结构"突出"与
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扩展青霉脂肪酶（Penicillium expansum Lipase,PEL）在催化三脂酰甘油酯时几乎没有位置选择性。利用YASARA View对PEL的三维结构（PDB:3G7N）进行分析发现,在其底物结合口袋上方有一个指向"盖子"的柔性环状突出（位于整体结构的C端）,该柔性结构上具有与酶催化活性密切相关的疏水性氨基酸237V。通过三级结构比对,我们发现PEL分子中这个C端的环状结构"突出"与同源的脂肪酶中的对应结构具有较大的不同,因此,这个结构域极有可能造成PEL与其他脂肪酶之间的性质（如位置选择性等）差异。为了探究该结构域与扩展青霉脂肪酶的催化性质之间的关系,我们利用同源比对、同源置换、双位点饱和突变、重组蛋白表达、薄层层析、高效液相色谱和分子对接等技术对PEL的C端环状结构域进行了系统的探究。本课题的主要研究内容如下:（1）利用不同长度的同源肽段,置换PEL的C端环状结构域——Loop PE（233～236位氨基酸:GMYA）。获得的同源置换突变体PEL-loop TL、PEL-loop AO、PEL-loop RN和PEL-loop RM催化三辛酸甘油酯水解的活力下降,反应动力学参数kcat/Km值都低于野生型脂肪酶（Wild-type lipase,WT）。薄层层析和高效液相色谱分析的结果显示:突变体PEL-loop TL、PEL-loop RN和PEL-loop RM都不具位置选择性;只有突变体PEL-loop AO具有明显的位置选择性。（2）构建G233NNK/M234NNK和Y235NNK/A236NNK突变文库,从三辛酸甘油酯乳化液平板上筛选具有不同类型水解圈的突变体。从这些突变体中挑出三个代表:突变体M234Q（半透明水解圈）、M234F（完全透明圈大小与WT相近）和Y235T/A236G（完全透明圈大于WT）。突变体M234Q和M234F催化三辛酸甘油酯水解的反应动力学参数kcat/Km值分别都低于WT;Y235T/A236G的kcat/Km值高于WT。薄层层析和高效液相色谱分析的结果显示突变体Y235T/A236G不具位置选择性;M234F和M234Q具有不同程度的sn-1,3位置选择性（其专一性比值分别约为WT的8.5倍和4.4倍）。（3）突变体脂肪酶对丁酸苄酯催化活性的探究。突变体M234F和Y235T/A236G的kcat/Km值都高于WT。利用YASARA View分析发现,维持或者提高C-端"突出"柔性结构域的疏水性,能提高脂肪酶对疏水性较高的丁酸苄酯的亲和性。（4）同源置换及饱和突变的结果表明,扩展青霉脂肪酶C端的环状结构域的改变能够显著影响酶催化的位置选择性。利用Autodock等生物信息学软件分析结果表明,造成位置选择性变化的原因可能主要有以下两个:一是由于化学键C1-C2、C2-C3和C2-O14构成了一个刚性结构,C2为这个刚性结构的中心。sn-2酯键离三辛酸甘油酯的刚性中心最近,因此sn-2酯键上的单键发生扭转的“灵活度”低于sn-1（3）。在形成sn-1（3）催化构象时,由于sn-1（3）酯键能够较容易适应底物结合口袋结构的改变而调整,从而继续形成正确羰基氧指向、合理攻击距离的sn-1（3）催化构象;而在形成sn-2催化构象时,sn-2酯键的低“灵活度”使得其不容易适应底物结合口袋的结构的变化而调整形成正确的羰基氧指向、合理攻击距离的sn-2催化构象。简而言之,由于“灵活度”的差异,sn-1（3）催化构象比sn-2催化构象更容易形成。二是在突变体中的“桥”状结构下方的空间明显小于WT（237V与71F之间的桥状结构）,空间位阻的增加使得易受结合空间影响的sn-2催化构像更难以形成,因此突变体显示出较明显的sn-1,3选择性。
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