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梅花(Prunus mume Sieb.et Zucc.)是中国的传统名花,具有很高的观赏价值和丰富的文化内涵。梅花的一个非常重要的生物学特性是在早春相对低温下开放。研究表明,梅花的这一特性与花芽休眠解除紧密相关。休眠是多年生植物进化的一种自我保护机制,是一个非常复杂的生理生化过程,受外界环境和内部生理的共同调控。研究表明,激素和糖在花芽休眠解除过程中起到非常重要的调节作用,其调控机制非常复杂,而GAMYB转录因子和α-淀粉酶(α-amylase)起到关键的作用。梅花花芽休眠解除研究很少,其分子调控机制尚不明确。本研究以梅花品种‘早绿萼’(Pmume’Zao lve’)为试验材料,根据花芽萌芽率(bud flush rate)界定4个休眠时期,分别对其进行转录组、小RNA和降解组测序,并结合酵母双杂交、双分子荧光互补和酵母单杂交等技术,对梅花GAMYB蛋白互作模式,及GAMYB调控梅花α-淀粉酶(PmAMY)基因表达进行深入研究,提出梅花花芽休眠解除分子调控模型。其主要试验结果如下:(1)根据花芽萌芽率将内休眠(Endo-dormancy,ED)划分为三个时期,分别为EDI(萌芽率为0%)、EDII(萌芽率为45%)和EDIII(萌芽率90%)。同时将自然条件下花芽萌动(Natural flush)时期确定为NF时期。在花芽休眠解除过程中,花芽内部ABA含量在EDI至NF时期显著下降,GAi、GA3、GA4和IAA在EDI至EDII时期下降,随后显著上升,且ABA/GA3比值持续显著下降。淀粉含量持续显著下降,可溶性总糖、葡萄糖、蔗糖的含量显著上升。(2)对4个休眠时期进行转录组测序,共得到5831个显著差异基因。小RNA测序,共预测到186个保守miRNA和183个梅花新miRNA,其中80个保守miRNA和124个新miRNA可以检测到靶基因。降解组测序共发现89个miRNA,对应205个靶基因和231个剪切事件,其中包括45个保守miRNA,其靶基因为121个,有132个剪切事件。5’RACE结果表明,Pm016605同时可以被miR159a和miR319a-3p剪切。(3)在梅花基因组中鉴定2个高度保守的GAMYB基因,其中PmGAMYB2的表达量随着花芽休眠解除而显著升高,而PmAMYB1的表达量在EDI到EDIII时期非常低,但在NF时期显著升高。GA3促进其表达,而ABA抑制其表达。亚细胞定位表明,PmGAMYBs蛋白主要在细胞核内表达。诱饵毒性和自激活检测表明,2个PmGAMYB蛋白均没有毒性,PmGAMYB1存在自激活现象,而PmGAMYB2没有自激活现象。PmGAMYB2蛋白可以形成同源二聚体,也可以和PmGAMYB1形成异源二聚体。由此推断,在花芽内休眠解除过程中,PmGAMYB2形成同源二聚体发挥重要作用,在NF时期,PmGAMYB2不仅形成同源二聚体,而且还与PmGAMYB1形成异源二聚体发挥作用。(4)在梅花基因组中鉴定7个高度保守的PmAMYs基因,其中PmAMY1、PmAMY3、PmAMY6和PmAMY7基因上游启动子序列含有GARE、MBS、TATA和TC等重要的保守结构域,且都具有活性。亚细胞定位表明,PmAMY蛋白主要在质体(叶绿体)表达。酵母单杂交结果表明,PmGAMYB2可以与PmAMYs基因上游启动子GARE(TAACAAA)进行结合,促进其表达,将其突变后(TTTTAAA),不能调控其表达。总之,本研究首次整合mRNA、sRNA和降解组数据,并结合一系列生理生化及分子生物学试验,分析梅花花芽休眠解除分子调控机制,为以后梅花休眠和花期研究奠定了理论基础。