论文部分内容阅读
研究背景:乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤,是造成全球女性死亡的第二大肿瘤。肿瘤中一小部分具有自我更新和多向分化能力的细胞,在维持肿瘤生长、促进侵袭转移以及放化疗抵抗中起重要作用,被称为肿瘤干细胞。肿瘤干细胞已经在白血病、乳腺癌、肝癌、胃癌、前列腺癌和肺癌等多种恶性肿瘤中被证实存在。CD44+/CD24-和乙醛脱氢酶1(ALDH1)等被用作乳腺癌干细胞筛选标记物。盐霉素是一种元羧酸聚醚类抗生素,最初被用于治疗家禽类的球虫病。近来有研究发现盐霉素对乳腺癌干细胞的杀伤作用是乳腺癌最常用的化疗药物紫杉醇的100倍,但其选择性杀伤乳腺癌干细胞的作用机制尚不清楚。有报道盐霉素可通过靶向Hedgehog信号通路而抑制乳腺癌干细胞增殖。在骨肉瘤和胃癌中,盐霉素可通过抑制Wnt/b-catenin信号通路而对干细胞起到细胞毒性作用。microRNAs(miRNAs)是一种长度在19-25个核苷酸的单链非编码小RNA分子,其通过碱基互补配对方式与靶基因mRNA 3’UTR区域结合,导致靶mRNA降解或抑制其翻译,在增殖、分化和凋亡等生物学过程中发挥重要作用。miRNAs异常表达与乳腺癌干细胞增殖有关。其中micro RNA-221(miR-221)在乳腺癌细胞MCF-7形成的乳腺球中表达增高,MCF-7乳腺球细胞可在裸鼠产生更大的移植瘤,miR-221可能通过靶向调节ER-α和ATXN1等诱导乳腺癌细胞上皮-间质转化(EMT)过程,或者通过抑制DNMT3b表达,增强乳腺癌细胞干性。此外,抑癌基因phosphatase and tensin homolog(PTEN)在胃癌和宫颈癌中被证明是miR-221的直接靶点,而PTEN失活可促进其下游的PI3K/Akt信号通路活性,在正常乳腺干细胞和乳腺癌干细胞中起重要调控作用。目的:(1)探讨miR-221促进乳腺癌干细胞增殖与PTEN/PI3K/Akt信号通路的关系;(2)探讨盐霉素选择性杀伤乳腺癌细胞干细胞的作用与miR-221及其调控的PTEN/PI3K/Akt信号通路的关系。方法:(1)以乳腺癌MCF-7细胞为实验对象,利用lipofectamine2000转染miR-221mimic(miR-221)、miRNA无关序列(NC)和PTEN si RNA(siPTEN)。Taqman探针法qRT-PCR检测miR-221表达水平。CCK-8和平板克隆实验检测miR-221上调或PTEN敲低对乳腺癌细胞增殖能力的影响。乳腺球微球体培养实验检测miR-221上调或PTEN敲低对乳腺癌干细胞增殖能力的影响。SYBR Green染料法qRT-PCR检测PTEN mRNA水平,Western blot检测PTEN及其下游因子p-Akt、NF-κB(p65、p-p65)和COX-2,以及乳腺癌干细胞标记物ALDH1表达。探讨miR-221促进乳腺癌细胞和乳腺癌干细胞增殖的机制。(2)CCK-8实验检测盐霉素在MCF-7细胞中的半数致死浓度(IC50)。乳腺球微球体培养实验检测盐霉素对miR-221上调的乳腺癌细胞成球能力的影响,Taqman探针法qRT-PCR检测盐霉素作用后miR-221水平变化,SYBR Green染料法qRT-PCR检测PTEN mRNA水平,Western blot检测PTEN及其下游因子p-Akt、NF-κB(p65、p-p65)和COX-2,以及乳腺癌干细胞标记物ALDH1表达。体外实验探讨盐霉素抑制乳腺癌干细胞增殖与miR-221及其调节的信号通路的关系。(3)慢病毒表达载体LV-hsa-miR-221感染MCF-7细胞,裸鼠右侧腹部皮下注射1′106个细胞。待肿瘤体积达到100mm3时,将裸鼠随机分为两组,一组盐霉素4mg/kg腹腔注射,隔天一次,另一组注射等剂量DMSO。定期观察并测量裸鼠体重和肿瘤大小。给药7次后处死裸鼠,取出移植瘤组织。部分提取RNA,实时荧光qRT-PCR检测miR-221和PTEN mRNA水平;部分提取蛋白质,Western blot检测PTEN及其下游因子p-Akt、NF-κB(p65、p-p65)和COX-2,以及乳腺癌干细胞标记物ALDH1表达。体内实验探讨盐霉素抑制乳腺癌干细胞增殖与miR-221及其调节的信号通路的关系。结果:(1)实时荧光qRT-PCR和Western blot结果显示miR-221组和siPTEN组PTEN mRNA和蛋白水平均显著低于阴性对照Control组和NC组(P<0.05)。(2)平板克隆实验结果显示,miR-221组细胞克隆数为730±40.4,与Control组(400±23.1)和NC组(454±50.3)相比,差异显著(P<0.05),而与siPTEN组(870.8±78.2)相比则无显著差异(P>0.05)。CCK-8结果显示miR-221组和siPTEN组与Control和NC组相比,细胞增殖能力显著增强。乳腺球培养实验显示miR-221组和siPTEN组形成的乳腺球体积明显比Control组和NC组大,进而统计孔板内微球体数目,结果发现miR-221组形成281±17.5个乳腺球,siPTEN组为306±12.3个,均显著多于Control组(200±23.1)和NC组(181±23.5),P值均小于0.05。Western blot显示miR-221转染和PTEN敲低可使ALDH1蛋白表达明显增多,PTEN下游因子p-Akt、NF-κB(p65、p-p65)和COX-2表达也明显增高。(3)Taqman探针法qRT-PCR结果显示盐霉素能明显降低MCF-7细胞内源性miR-221表达水平(P<0.05);药物作用曲线结果表明盐霉素半数致死浓度(IC50)为1μM,用于盐霉素相关实验。与miR-221组相比,盐霉素处理组(Sal-miR-221)乳腺球体积明显变小,数量明显减少(117±9.4 vs 180±15.6,P<0.05),ALDH1蛋白表达明显降低。实时荧光qRT-PCR结果显示盐霉素作用后MCF-7细胞(Sal-miR-221组)中miR-221水平明显降低(P<0.05),而PTEN mRNA水平显著升高(P<0.05,Western blot显示PTEN蛋白表达也增高,PTEN下游因子p-Akt、p65和p-p65以及COX-2表达均增高。(4)盐霉素给药组裸鼠皮下瘤体积明显小于对照组,皮下瘤组织内miR-221表达水平明显低于对照组(P<0.05),PTEN mRNA表达水平明显升高(P<0.05),PTEN蛋白增高,其下游因子p-Akt、NF-κB(p65、p-p65)以及COX-2表达均降低,干细胞标记物ALDH1表达亦明显降低。结论:(1)在乳腺癌细胞中miR-221可在转录后水平抑制PTEN表达。(2)miR-221促进乳腺癌细胞和乳腺癌干细胞增殖,可能与miR-221下调PTEN表达,导致其下游Akt磷酸化,激活NF-κB信号通路,促进COX-2表达有关。(3)体内外实验结果表明盐霉素抑制乳腺癌干细胞增殖能力,可能通过降低miR-221水平,进而升高PTEN表达,使其下游因子Akt去磷酸化,抑制NF-κB活性和COX-2表达所致。盐霉素在乳腺癌治疗中可能具有重要应用价值。