背景和目的依据GLOBOCAN 2012数据,肺癌仍是最常见及致死率最高的恶性肿瘤。尽管近年来依靠影像技术和化疗药物的更新在诊断和治疗方面取得了进展,但其5年生存率仍然低于20%。肺癌5年生存率停滞不前的主要原因是:(1)早期症状不典型,大多数患者确诊时已是中晚期,仅有30%的患者能行根治性手术切除;(2)极易出现淋巴结转移和血行转移,即使是能行根治性手术切除的患者亦有50%在5年内会出现复发转移。(3)EGFR突变和ALK重排的识别在非小细胞肺癌中(NSCLC)开启了基于基因标志选择合适人群进行个体化治疗的时代。然而,EGFR突变和ALK重排仅,分别见于23%和6%的肺腺癌患者。大部分肺癌仍缺乏有效治疗,提示我们探究肺癌进展和转移的分子机制,探寻新的干预靶点,对提高肺癌的治愈率和生存率,延长患者生命有着极其重要的临床指导意义。microRNA是一类在真核细胞中广泛存在的长约22个核苷酸的单链非编码小RNA,在肿瘤发生发展过程中扮演着促癌或抑癌的双重角色,参与到肿瘤进展及转移各个环节的调节。针对肺癌的差异表达芯片分析已发现十余个与肺癌发生发展相关的miRNAs。其中一些miRNAs在非小细胞肺癌中的作用已得到了证实。例如miR-21的高表达与肺癌患者的复发及不良预后相关,且可直接抑制重要的抑癌基因PTEN,促进非小细胞肺癌的生长、侵袭迁移及放化疗抵抗,还与EGFR-TKI获得性耐药相关。不仅如此,更重要的是miRNA具有在石蜡标本、外周血、痰液、尿等多种标本中长期存在的稳定性,以及有多基因靶向性,这些自身特性决定了 miRNA在肺癌诊断、分子分型、疗效预测、预后判断以及靶向治疗等方面具有广阔的应用前景。这些结果展示了 miRNA作为肿瘤标志物以及肺癌治疗靶点的巨大潜能。miR-744是我们前期在肺癌细胞中筛选到的转移相关基因MTA1干扰后发生变化的microRNA,我们在预实验研究中发现miR-744在非小细胞肺癌细胞株、组织及血清中表达上调,与淋巴结转移及不良预后相关,功能学实验显示miR-744能促进肺癌细胞的侵袭迁移能力,提示miR-744在非小细胞肺癌中发挥了促癌基因的作用。然而,迄今关于miR-744在肿瘤领域中的研究为数不多,因此,深入探讨miR-744在非小细胞肺癌侵袭转移中的生物学功能并阐明其上下游调控分子机制,对于非小细胞肺癌转移的预测、诊断、预后判断、干预及药物研制均具有重要指导意义。在本研究中,我们拟通过生物信息学网站预测并结合文献报道,筛选出非小细胞肺癌中miR-744靶向c-FOS启动子区域,再用双荧光素酶报告基因系统验证miR-744通过直接与c-FOS启动子结合在转录水平调节其表达。并通过一系列体外实验证实miR-744介导了候选靶基因c-FOS对非小细胞肺癌细胞增殖、侵袭迁移能力的影响。失调miR-744的表达检测其对紫杉醇药物作用细胞抑制生长的影响,并探索失调miR-744后其对肺癌细胞放射敏感性影响。最后,在非小细胞肺癌组织标本中及TCGA数据库证实候选miRNA与c-FOS表达之间的相关性。材料和方法1.临床标本收集15对原发性肺癌癌组织及其相应癌旁组织标本。所有患者签署知情同意书,该程序获得南方医院临床研究伦理委员会的批准。所有患者术前都未曾接受放疗或化疗。所有样品立即置于-80℃液氮保存,并对癌旁组织及肿瘤组织病理学分析验证组织类型。2.数据库挖掘方法从癌症基因组计划(TCGA)数据库下载肺癌的分析数据集(http://cancergenome.NIH.gov/)[16]。3.细胞系与细胞培养细胞是从美国模式菌种收集中心购买A549和H520(ATCC,美国),和SPC-A-1,H1299细胞由中国科学院上海细胞库购买(上海,中国)。所有的培养于RPMI-1640培养基(康宁、NY、美国)含10%胎牛血清(FBS、Gibco、南美洲、NY、美国)。所有细胞均于37℃、5%CO2条件下培养。4.稳定转染miR-744的前体序列由上海吉凯公司合成并插入GV209载体中,构建稳定过表达miR-744慢病毒的载体,命名为LV-miR-744。并含无关序列载体做为对照。将慢病毒转入A549和H520细胞中并经嘌呤霉素筛选及qRT-PCR验证获得稳定过表达miR-744肺癌细胞株。5.寡核苷酸构建、瞬时转染antagomir-744,antagomir 阴性对照(antagomir-NC),agomir-744,agomir阴性对照(agomir-NC)的设计合成由锐博生物科技提供(广州市,中国)。si-c-fos和si-control的设计合成由吉玛生物公司提供(上海,中国)。瞬时转染按照Lipofectamine TM 3000 说明书进行操作,A549,SPC-A-1,H1299 和 H520 肺癌细胞培养在6孔板中,转染48或72小时后进行后续试验。6.RNA提取及荧光定量PCR从肺癌细胞和组织中提取总RNA,经逆转录形成cDNA,根据SYBR Green法进行荧光定量PCR。7.细胞生物学试验[1]CCK8实验:用来表示细胞生长抑制率。[2]平板克隆实验:用来检测放疗敏感性。[3]Edu细胞增殖检测:荧光显微镜下计数Edu阳性细胞数,用来表示细胞增殖。[4]划痕实验:不同时间点检测细胞的迁移率。[6]迁移和侵袭实验:于显微镜下计数穿膜细胞数,表示肿瘤细胞迁移、侵袭能力。8.动物实验-皮下及转移瘤模型[1]动物皮下瘤实验:将 antagomir-744 干扰的 A549/mir-744,和 antagomir-NC对照组A549/control分别接种于5只裸鼠左、右侧后背部皮下,每侧4x 106细胞。同样的,将稳定过表达miR-744的H520/miR-744和对照组H520/control分别接种于5只裸鼠。[2]肺转移瘤模型:将稳定过表达miR-744的A549/miR-744和对照组A549/control 及稳定过表达 miR-744 的 H520/miR-744 和对照组 H520/control分别注射入裸鼠尾静脉中,2x106细胞/只,5只/组。30天后整体可视化观察肺部转移情况,进行活体成像后,将裸鼠处死,取出肺组织HE染色后,光学显微镜观察计数转移瘤个数。9.双荧光素酶活性检测按照Dual-Luciferase(?)Reporter Assay System说明书操作,将转染后的细胞于酶标仪上分别测定Fireflyluciferase和Renilla luciferase的活性,以pRL-TK质粒作为内参,计算上述两荧光素酶活性的比值,比较不同样品间的差异。10.Western blot提取细胞总蛋白,用BCA法测定蛋白浓度,然后经蛋白变性、电泳、转膜、封闭、免疫杂交、显影后,采用Quantity One软件进行蛋白表达相对定量。11.统计学分析采用SPSS 13.0软件进行统计学分析。qRT-PCR各细胞株相对表达量采用Brown-Forsythe法;CCK8生长曲线比较采用析因设计的方差分析;体内外功能实验采用两独立样本t检验。miR-744与c-FOS表达的相关性分析采用Spearman相关系数。所有数据均进行3次独立重复实验,数值以均数±SE来表示。P<0.05表示差异有统计学意义。结果1.miR-744在肺癌中的表达及临床意义TCGA肺癌数据分析,以ROC曲线法将样本分成miR744高表达(n=237)组和低表达组(n=219),显示miR744的表达与肺癌生存相关高表达组vs低表达组(p=0.0016)。进一步分析显示miR744在肺鳞癌与腺癌的表达量不同(p=0.007)。COX风险模型分析显示鳞癌中miR744高表达预后差(HR,2.685;95%CI,1.596-4.517;P = 0.000)。qRT-PCR 结果显示,与 HBE 相比,miR-744 在 95D,A549,H1299,H520肺癌细胞株中呈不同程度表达上调;在15例肺癌组织中,miR-744的平均表达水平比对应癌旁组织提高(fold difference = 2.053,P = 0.0329)。表明miR-744在肺癌中可能是一个促癌基因。2.miR-744在肺癌细胞中的生物学功能研究和药物敏感性,放疗敏感性检测选取人肺癌细胞株A549,SPC-A-1,H1299和H520作为细胞模型,通过miR-744表达失调的体内外功能实验,研究miR-744在肺癌细胞中的生物学功能。首先,瞬时转染miR-agomir或antagomir后可显著上调或下调miR-744的表达。其次,通过Transwell迁移侵袭,划痕,EDU实验观察到miR-744表达改变对肺癌细胞功能的影响显著。在此结果基础上,将antagomir-744干扰的A549和对照组A549/control分别接种于裸鼠,至第26天,A549/antagomir-744细胞所形成的肿瘤体积较对照细胞减小(t=5.9002,P=0.0029),且肿瘤的平均重量亦较对照细胞下降(t=39.1112,P=0.0013)。相反的,将稳定过表达 miR-744 的 H520/miR-744 和对照组H520/control分别接种于裸鼠,差异同样显著。构建持续过表达miR-744的细胞株A549/miR-744及H520/miR-744,建立裸鼠尾静脉注射肺转移模型。结果表明,实验组肺转移瘤大且数量较多,与对照组相比,实验组的肺转移明显增高(P=0.0306 和 P=0.0283)。此外紫衫醇药物实验显示,一定范围浓度内,随着浓度的递增,对A549细胞的增殖抑制作用逐渐增强;当化疗药物联合antagomir-744后,抑制作用比单纯化疗药物具有上升趋势。紫杉醇单药的IC50为5.191nmol/L,当联合antagomir-744 后,IC50 降至 4.104nmol/L(下降 20.94%),P=0.029;当化疗药物联合过表达miR-744后,抑制作用比单纯化疗药物具有下降趋势。紫杉醇单药的IC50为4.961nmol/L,当联合744后,IC50升至5.943nmol/L(上升19.79%),P=0.036。同样,H520的药物实验结果也显示明显趋势。分别对A549和H520细胞照射OGY,2GY,4GY,6GY,8GY后绘制存活曲线显示过表达miR-744细胞存活分数明显高于对照组细胞,干扰miR-744细胞细胞存活分数明显低于对照组细胞。以上结果显示,miR-744参与了肺癌的进展及转移过程,其表达失调与肺癌细胞的体内外增殖及转移密切相关,在肺癌中起着促癌基因的作用。3.miR-744促进肺癌细胞侵袭迁移的分子机制目前,c-FOS已被证实能促进多种肿瘤细胞的增殖迁移侵袭。通过qRT-PCR及WB检测miR-744失调后的肺癌细胞株A549,SPC-A-1,H1299和H520中c-FOS mRNA和蛋白的表达,我们发现miR-744过表达后可显著上调肺癌细胞株中c-FOS mRNA和蛋白的表达,而抑制则表达降低。利用RNAhybrid miRanda、TargetScan软件预测miR-744的靶基因,并未发现miR-744存在靶向c-FOS3’UTR的结合位点,而利用RNAhybrid我们发现miR-744在c-FOS的启动子区存在4个可能结合位点(Site 1,-1227 to-1195;Site 2,-358 to-332;Site 3,-323 to-298;Site 4,-221 to-192)。因此,我们将含有预测结合位点的c-FOS的启动子区克隆到报告基因载体pGL3中,检测荧光素酶活性,过表达miR-744比对照组使细胞中pGL3-c-FOS的荧光素酶活性提高。而后构建相应预测结合位点的突变序列,Site 1和Site 3荧光素酶活性明显下降,表明miR-744与c-FOS的site 1和Site 3可特异性结合。基于以上结果,我们分别将si-c-FOS及si-c-FOS-NC与agomir-744及agomir-NC共转染后进行功能回复实验。通过qRT-PCR及Western blot检测我们发现,与对照组相比,上调miR-744能升高c-FOS基因及蛋白水平的表达,干扰c-FOS能显著降低c-FOS基因及蛋白水平的表达,而共转染si-c-FOS及agomir-744后可部分逆转agomir-744对c-FOS基因及蛋白水平表达的影响。此外,我们还进行了 Transwell迁移实验和Boyden侵袭实验,进一步从功能实验证实miR-744对肺癌细胞迁移和侵袭能力的影响是通过调控c-FOS实现的。结论1.miR-744在肺癌组织和细胞株中表达上调,且与肺癌的生存相关。2.miR-744参与了肺癌的发病及转移机制,其表达失调可影响肺癌细胞的体内外增殖和转移能力,药物敏感性,放疗敏感性,扮演着癌基因的角色。3.在肺癌中,c-FOS为miR-744的靶基因,miR-744通过直接靶向c-FOS启动子促进其转录从而促进肺癌细胞迁移和侵袭。进一步验证miR-744与MAPK通路相关。