NK/T细胞淋巴瘤(Natural Killer T–Cell Lymphoma，NKTCL)为非霍奇金淋巴瘤的一个亚型，发病率居T细胞淋巴瘤的首位，具有独特流行病学分布特征，在东亚及拉丁美洲地区多见，而在欧美国家少见，具体的发病原因仍不明确，通常认为与EB病毒感染及慢性鼻炎有关，也有学者认为遗传因素可能在其中起到一定的作用，是近年来淋巴瘤研究的热门。PTEN基因称之为第10号染色体缺失性磷酸酶-张力蛋白同源性基因（phosphatase and tensinhomology deleted on chromosome Ten， PTEN），是迄今发现的第一个具有磷酸酶活性的抑癌基因，研究发现PTEN可能通过对酪氨酸的磷酸化的抑制作用、负调节细胞的增殖作用，同时参与细胞周期的调控作用，其突变、缺失，蛋白表达异常，最终可能导致肿瘤发生。PTEN的研究已成为肿瘤学特别是淋巴造血系统肿瘤研究的热点，但在NK/T细胞淋巴瘤中的研究较少，PTEN基因及其通路对NK/T细胞淋巴瘤有何生物学特性影响及其分子机制还有待于进一步的研究。本课题首先在临床患者肿瘤组织标本中检测PTEN基因表达情况，然后利用慢病毒载体和RNAi技术，构建分别携带PTEN cDNA和shPTEN的重组慢病毒载体，感染NK/T细胞淋巴瘤细胞系，研究PTEN基因对于NK/T细胞淋巴瘤细胞的生长增殖、凋亡诱导、细胞周期、化疗药物敏感性等生物学特性的作用，同时检测相关分子通路基因，探索PTEN基因在NK/T细胞淋巴瘤中的生物学功能和分子机制，为NK/T细胞淋巴瘤的临床诊治提供潜在的分子标志物和靶基因。实验目的：1.检测PTEN基因在NK/T细胞淋巴瘤组织以及反应性增生淋巴结组织表达情况，分析与临床病理参数、疗效之间的关系。2.构建并制备携带PTEN cDNA和PTEN-shRNA的重组慢病毒载体，并进行相关功能鉴定。3.检测PTEN基因在NK/T细胞淋巴瘤细胞系SNK-6和正常NK细胞中的表达，研究PTEN基因的表达对SNK-6细胞生长增殖、凋亡、细胞周期、化疗药物敏感性等生物学特征的影响，检测PTEN相关分子通路和耐药基因的表达，初步明确相关分子机制。内容：第一部分：PTEN在NK/T细胞淋巴瘤组织中的表达及意义方法：1. HE染色（苏木精伊红染色）：石蜡组织包埋切片进行脱蜡，染色，脱水后观察NK/T细胞淋巴瘤组织中肿瘤细胞形态和组织学特点。2.免疫组化检测PTEN蛋白在NK/T细胞淋巴瘤中的表达：经过脱蜡，抗原修复，消除内源性过氧化物酶活性，一抗孵育，二抗孵育，DAB显色，苏木精复染，封片过程，显示在NK/T细胞淋巴瘤组织中PTEN的表达情况。结果：1. HE染色结果发现肿瘤细胞呈弥漫浸润性生长，组织坏死明显，粘膜面有溃疡形成，肿瘤细胞形态单一、中等大小，胞质淡染至透亮，浸润并破坏血管壁。免疫组化结果显示PTEN在NK/T细胞淋巴瘤组织中阳性表达率为32.0%（16/50），显著低于反应性增生淋巴结86.7%（26/30），两者比较差异有统计学意义（P <0.01）。2. PTEN在NK/T细胞淋巴瘤中的表达与临床病理参数的关系：NK/T细胞淋巴瘤组织中PTEN阳性表达率与患者年龄、性别、发生部位、临床分期、乳酸脱氢酶（LDH）水平均无相关性，差异无统计学意义（P>0.05）。与Ki-67指数呈负相关，差异有统计学意义（P <0.05）。根据疗效评价（2周期）可将淋巴瘤患者分为治疗有效组（CR+PR）和治疗无效组（SD+PD），结果显示PTEN在NK／T细胞淋巴瘤中的表达阳性率在有效组（42.1%）明显高于无效组（16.1%）（P<0.05）。第二部分：携带PTEN cDNA和shRNA重组慢病毒的制备和感染效率测定方法：1. PTEN高表达慢病毒载体构建：将pCDH-CMV-MCS-EF1–cop GFP载体用EcoRI和BamHI酶切，PTEN克隆载体为模版PCR产物用EcoRI和BamHI酶切，连接转化构建PTEN基因高表达慢病毒载体pCDH-PTEN。2. PTEN干扰表达慢病毒载体构建及干扰效率筛选：设计合成PTEN基因shRNA，退火形成双链片段，干扰慢病毒载体pLL3.7用HpaI和XhoI酶切，通过连接，转化鉴定，构建PTEN基因干扰慢病毒载体pLL-shPTEN1，pLL-shPTEN2和pLL-shPTEN3。通过Real time PCR鉴定筛选出高效干扰的pLL-shPTEN。3.慢病毒包装，纯化，浓缩及滴度测定：共转染慢病毒载体，包装质粒Δ8.2和包膜质粒VSV-G于293T细胞中，72h收获病毒，通过高速离心法进行纯化浓缩病毒，通过梯度稀释法进行滴度测定。4.慢病毒对淋巴细胞感染效率测定：用不同MOI=0.1,1,10,100,1000对正常淋巴瘤细胞感染后通过荧光观察测定绿色荧光细胞占细胞总数的比例。通过流式细胞仪检测有GFP表达的细胞比例。结果：1. pCDH-PTEN慢病毒表达载体酶切鉴定正确，测序结构与NCBI中参考序列一致，说明PTEN基因高表达慢病毒载体pCDH-PTEN构建成功。2.酶切及测序结果显示pLL-shRNA1，pLL-shRNA2和pLL-shRNA3构建成功，其中pLL-shRNA2干扰效率最高，选择pLL-shRNA2进行下面病毒包装。3.通过慢病毒感染结果可知Lenti-con，Lenti-PTEN以及Lenti-shPTEN慢病毒包装成功，并且纯化浓缩后病毒滴度可以达到109IFU/ml。4.通过对SNK-6和YTS细胞的感染效率的测定发现当MOI=100时病毒感染效率可以达到60%以上，可以满足下游实验需求。第三部分：重组慢病毒Lenti-PTEN及Lenti-shPTEN功能测定和对SNK-6细胞生物学特性影响方法：1. Real time PCR及Western Blot分析正常NK细胞和SNK-6细胞中PTEN基因mRNA和蛋白表达水平。重组慢病毒Lenti-PTEN和Lenti-shPTEN感染正常NK/T细胞淋巴瘤细胞和SNK-6细胞后，利用Real time PCR及Western Blot检测PTEN基因表达。2.重组慢病毒感染SNK-6细胞后，为评价PTEN基因对淋巴瘤细胞生长抑制作用，进行形态学观察和CCK8检测细胞增殖能力变化。重组慢病毒感染SNK-6细胞和正常NK淋巴细胞后，利用流式细胞仪通过细胞周期及凋亡检测试剂盒分析PTEN基因对人淋巴瘤细胞周期及凋亡的影响。重组慢病毒感染SNK-6细胞和正常NK淋巴细胞后，通过不同浓度顺铂（8.0μg/mL、2.0μg/mL、0.5μg/mL、0.125μg/mL、0.03125μg/mL、0μg/mL）对细胞进行处理，CCK8检测药物作用后细胞增殖情况。3.重组慢病毒感染SNK-6细胞，通过Western Blot分析PI3K/AKT通路和耐药基因蛋白表达量的变化。结果：1. Realtime PCR以及western blot分析结果表明均表明，PTEN基因在正常NK细胞和NK/T细胞淋巴瘤细胞系SNK-6中均有表达，较正常NK细胞相比，SNK-6细胞中表达量明显下降。另外，重组慢病毒感染SNK-6细胞后，高表达PTEN的重组慢病毒感染SNK-6细胞系后，SNK-6细胞中PTEN的表达明显增高（P<0.05），干扰PTEN基因表达的重组慢病毒感染SNK-6细胞系后，SNK-6细胞中PTEN的表达明显降低（P<0.05），降低了70%以上。2.重组慢病毒Lenti-PTEN作用后的淋巴瘤细胞不同程度出现细胞病理变化，即生长受到抑制，细胞分散，可见不同程度细胞碎片，细胞折光度欠佳，细胞挛缩。重组慢病毒Lenti-shPTEN作用SNK-6细胞后，发现细胞增长速度稍有增加，细胞状态与对照组及Lenti-con相比差别不大。重组慢病毒Lenti-PTEN对于SNK-6细胞的抑制作用明显（P<0.05），达到了42.03%±5.15，而重组慢病毒Lenti-shPTEN感染组相对Lenti-con组对SNK-6细胞的增殖作用无明显差异（P>0.05）。重组慢病毒Lenti-PTEN可以通过诱导淋巴瘤细胞凋亡，抑制淋巴瘤细胞生长和增殖。不同浓度梯度DDP对SNK-6细胞作用呈现明显浓度剂量依赖性，即随浓度剂量的提高，DDP对细胞的增殖抑制率持续上升，重组病毒Lenti-con组和Lenti-shPTEN组细胞对DDP的增殖抑制率无明显变化（P>0.05）。重组慢病毒Lenti-PTEN感染后，细胞增殖抑制率较其他各组相比，抑制率均明显提高（P<0.05），同时DDP对重组慢病毒Lenti-PTEN作用后SNK-6细胞的IC50值（0.0894±0.0073）较其他各组明显下降（P<0.05），表明PTEN基因可以增强化疗药物顺铂对SNK-6细胞的细胞毒作用。3. PTEN基因的高表达可以明显抑制PI3K、p-Akt、mTOR、ABCC4基因的表达，但对MDR-1影响不明显。结论：1. PTEN基因在NK／T细胞淋巴瘤组织和细胞系中相对低表达。NK／T细胞淋巴瘤组织中PTEN阳性表达率与Ki-67指数和疗效呈负相关。提示PTEN可能与NK／T细胞淋巴瘤发生发展关系密切，并有可能作为疗效判定的潜在分子标志物。2.成功包装出三种重组慢病毒lenti-PTEN和lenti-shPTEN，可有效感染NK/T细胞淋巴瘤SNK-6和YTS细胞株，并显著提高和降低NK/T细胞淋巴瘤细胞系SNK-6细胞中PTEN基因的表达。3. PTEN基因的表达可以有效抑制SNK-6细胞的增殖，诱导其凋亡，并逆转SNK-6细胞顺铂耐药，机制可能与PI3K/Akt通路以及mTOR基因和ABCC4基因有关。