索科线虫和微孢子虫侵染五条蚋幼虫的组织学和转录组学研究

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目的:实地调查贵阳吸血优势种五条蚋的寄生物类群,研究寄生物感染对五条蚋幼虫发育及组织病理学影响,并用RNA-Seq技术初步探讨五条蚋被线虫寄生后基因表达水平的变化。方法:2015年和2018~2020年10~11月,在贵阳市青岩镇(26.333424°N,106.671725°E,海拔1036.87米)采集蚋类幼虫和蛹,成熟蛹孵育后获得成虫。酒精固定幼虫、蛹和成虫,形态学鉴定蚋种。在优势种五条蚋中晚龄期幼虫中筛选,获得寄生物侵染的幼虫,鉴定寄生物种类。实验室养殖寄后期线虫,酚乳油透明法和扫描电镜观察成虫形态学特征,测量分类学指标。结合组织学制片了解寄生期线虫列细胞和营养体构造,鉴定线虫种属。吉姆萨染色法观察侵染微孢子虫形态,石蜡切片和HE染色观察微孢子虫形成的异物囊组织学特征,鉴定微孢子虫种属。同时研究索科线虫和微孢子虫侵染对蚋产生的组织病理学影响。对侵染线虫蚋和健康对照蚋分别进行RNA-Seq,生物学重复3次,测序后进行生物信息学分析。结果:(1)在青岩采集点发现五条蚋、兴义维蚋、装饰短蚋、双齿蚋、黔蚋和崎岛蚋共6种蚋,其中五条蚋种群数量约占半数,是当地优势种。(2)筛查五条蚋幼虫共3343条,其中发现357条被索科线虫寄生,感染率5.079%~13.35%;118条被微孢子虫寄生,感染率1.870%~8.889%;8条被蚋腔壶菌寄生,感染率0%~0.496%。索科线虫的感染率最高。存在多重寄生现象。(3)在青岩五条蚋中寄生的索科线虫为同一物种,经鉴定为新种,定名为:青岩中索线虫Mesomermis qingyanese sp.nov.。该线虫头乳突6个;口端位;化感器大而圆;食道管长度未达体中部,管端部深入表皮;列细胞2列;雌虫阴道短梨形,阴道管V型弯曲;雄虫交合刺2根,平行,镰刀形弯曲;寄后期幼虫具有尖锥形尾附器。根据其表皮厚度、雄虫交合刺长度(约204μm),生殖乳突数量和排列形式可与其它种鉴别。(4)青岩中索线虫寄生会干扰宿主五条蚋幼虫的正常发育,使蚋幼虫难以化蛹;导致成虫盘发育明显迟滞;脂肪组织大量破坏和生殖腺缺失(或发育异常)等现象。(5)发现3种微孢子虫,分别隶属于泰罗汉孢虫属Thelohania、科多孢虫属Caudospora和匹里虫属Pleistophora,暂定名为Thelohania sp1、Caudospora sp1和Pleistophora sp1。Thelohania sp1寄生形成合胞体异物囊,而Caudospora sp1和Pleistophora sp1形成肿瘤状异物囊。(6)微孢子虫(Pleistophora sp1为代表)侵染蚋宿主的过程可分为3阶段:感染期、裂殖增殖期和孢子形成期。组织寄生先后顺序为:中肠→脂肪体、肌肉→马氏管、纺织腺、生殖腺、神经。被寄生组织器官的细胞中见到大量微孢子虫增殖,细胞核肥大,寄生泡形成。消化道肠上皮细胞间隙增宽,肠壁不规则断裂;脂肪组织、腺体组织和肌肉组织被破坏。(7)青岩中索线虫侵染蚋与对照蚋的转录组测序,共获得39.88 Gb数据,组装并去冗余后得到65404个Unigene,平均长度、N50和GC含量分别为770 bp、1208 bp和43.77%。七大数据库进行基因功能注释,最终分别有37647(NR:57.56%)、8342(NT:12.75%)、29840(Swiss Prot:45.62%)、29936(KOG:45.77%)、30945(KEGG:47.31%)、27357(GO:41.83%)和28539(Pfam:43.63%)个基因获得注释。检测到健康蚋和侵染线虫蚋差异表达显著的基因共437个,其中表达量上调243个,下调194个。表达量显著下调者主要为蛹几丁质相关表皮发育蛋白和内肽酶抑制剂活性相关的基因。结论:(1)调查发现贵州青岩五条蚋幼虫寄生索科线虫1种(新种:青岩中索线虫)、微孢子虫3种(Thelohania sp1、Caudospora sp1和Pleistophora sp1)和蚋腔壶菌1种(Coelomycidium simulii)。(2)青岩中索线虫和微孢子虫寄生均干扰蚋宿主的正常生长发育,线虫主要引起化蛹障碍、脂肪体破坏和生殖腺异常;微孢子虫主要使消化道、脂肪体、肌肉和生殖腺等组织出现病理性改变。(3)五条蚋幼虫被青岩中索线虫寄生后,蛹几丁质相关表皮发育蛋白和内肽酶抑制剂活性等相关基因表达下调,提示下一步可以从变态发育和免疫反应方面研究蚋对线虫的寄生应答。
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