研究背景糖尿病(diabetes mellitus, DM)是一种常见的代谢性内分泌疾病,是严重危害人类健康的三大慢性非传染性疾病之一。随着人口老龄化和生活方式的改变,糖尿病的患病率正呈现快速上升的趋势。根据世界卫生组织(WHO)的报告,全球糖尿病患者预计到2025年将上升到3亿,而届时我国糖尿病人很可能将突破5000万。目前糖尿病的发病机制尚未完全阐明。越来越多的证据表明,胰岛细胞损伤导致胰岛素生成与分泌不足贯穿于糖尿病发生和发展的全过程,是“糖尿病的核心问题”。已证实多种因素,如高浓度葡萄糖、脂肪酸、核糖等均可造成胰岛素分泌障碍。近年研究发现,晚期糖基化终产物(advanced glycosylation end products, AGEs)可诱导体外培养的胰岛细胞氧化应激,造成细胞凋亡和胰岛素分泌障碍。糖尿病患者,以及慢性肾脏病(chronic kidney disease, CKD)、肥胖和代谢综合征等糖尿病高危人群普遍存在氧化应激。活性氧介质(reactive oxygen species, ROS)修饰蛋白质后导致其结构和功能改变,其产物包括晚期蛋白质氧化产物(advance oxidant protein products, AOPPs)、AGEs等。糖尿病患者、慢性肾脏病、肥胖和代谢综合征等人群循环和组织中AGEs和AOPPs水平明显升高。越来越多的证据表明,AGEs和AOPPs不仅是机体氧化应激的产物,其自身也具有高度的促氧化和促炎症效应,被公认为具有多种致病作用的代谢毒素。AOPPs不仅在细胞毒性以及致病机制等方面与AGEs相似,而且我们证实AOPPs可通过AGEs的受体-RAGE介导活化人血管内皮细胞。但迄今为止AOPPs对胰岛细胞的作用尚不清楚。胰岛损伤及胰岛素分泌功能障碍的机制复杂。大量证据表明,胰岛局部的肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system, RAS)活化是胰岛素分泌功能障碍的重要机制。多种动物(包括犬科动物及啮齿类动物)和人胰岛中具有比较完整的RAS系统。血管紧张素1型受体(angiotensin receptor 1, AT1R)主要表达于β细胞,血管紧张素原(angiotensingen, AGT)主要分布于α细胞,血管紧张素转换酶(angiotensin converting enzyme, ACE)主要存在于胰岛内皮细胞内。体内及体外实验证据表明,胰岛局部RAS活化能够抑制胰岛血流或者直接调节胰岛细胞,从而抑制胰岛素的合成与释放。在缺氧、高糖、DM等各种病理状态下,都可导致胰岛局部RAS激活,胰岛素分泌降低。在糖尿病动物模型中,使用RAS系统抑制剂如血管紧张素转换酶抑制剂(angiotensin converting enzyme inhibitor, ACEI)类药物,血管紧张素拮抗剂(Angiotensin Receptors blocker, ARB)类药物能显著改善胰岛形态及功能,缓解糖尿病的发生发展。而临床研究也显示,在心血管高危因素人群中应用RAS系统抑制剂可显著降低2型DM的发生率。AGEs和AOPPs与组织局部RAS之间的效应研究较多的是糖尿病并发症,如糖尿病视网膜病变、糖尿病肾病、糖尿病血管病变,它可以活化多种组织和细胞的RAS系统。本实验室在血管内皮细胞、肾小管上皮细胞、系膜细胞模型上已经证实,AOPPs和AGEs可以诱导产生氧化应激,导致多种病理过程的发生发展。最近本实验室研究发现,AOPPs能够激活肾组织(如肾小管上皮细胞)RAS系统引起病理效应。鉴于此,我们假设AOPPs可能通过激活胰岛内RAS系统造成胰岛素分泌功能障碍。为验证上述假设,本研究以体外培养的大鼠原代胰岛为细胞模型,观察AOPPs对胰岛分泌胰岛素功能的影响,研究其对胰岛RAS活化的影响及其机制。研究方法以体外培养的大鼠原代胰岛为细胞模型,观察AOPPs对胰岛RAS系统及胰岛分泌功能的影响。1.无内毒素的氧化修饰大鼠血清白蛋白(AOPPs-RSA)的制备与鉴定用Guo ZJ等介绍的方法体外制备AOPPs-RSA。将20mg/ml无内毒素大鼠血清白蛋白(RSA)溶液与40mmol/l次氯酸(HOCl)等体积混合,室温放置30分钟,制备出RSA与次氯酸摩尔比1：140的AOPPs。制备的AOPPs在无内毒素PBS中透析24小时,以除去游离次氯酸。用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌后4℃保存。20mg/mlRSA与PBS等体积混合,作为对照。AOPPs含量通过测定酸性条件下340nm的吸光度值,以氯胺T为标准取得。制备的AOPPs-RSA和未经修饰的RSA用鲎试验法检测内毒素的含量。2.大鼠胰岛细胞的分离纯化采用胶原酶P胰管灌注消化,Ficoll-400不连续梯度纯化SD大鼠胰岛。DTZ染色鉴定其纯度。胰岛培养于ECM包被的培养板,加RPMI-1640培养基(含10%胎牛血清,11.1mmol/L葡萄糖、10mmol/LHEPES、50μmol/Lβ-巯基乙醇、1 mmol/L丙酮酸钠、0.1U／L青霉素、2mmol/L谷氨酰胺、100mg／L链霉素),置于5% CO2／95%空气的37℃孵箱中培养。采用贴壁后的胰岛(一般于培养2天后贴壁)用于本实验。3.胰岛分泌胰岛素功能的检测：每组吸取50个直径在150～200μm之间的胰岛细胞团,进行培养和处理后,洗涤细胞1次,加入3.3mmol/l葡萄糖的KRB液1ml,置于37℃、5%CO2的恒温培养箱中2h,再加入16.7mmol/l的KRB液1ml,继续培养2h,吸取上清液,-70℃保存,待测其中胰岛素含量。胰岛素测定采用ELISA法,结果用释放指数(16.7mmol/l葡萄糖KRB液中胰岛素含量与3.3mmol/l葡萄糖KRB液中胰岛素含量之比)表示。4.胰岛细胞内活性氧的检测：取同步生长的胰岛,加入0.1μmol/12,7-二氢二氯荧光素(DCFH)标记细胞,37℃孵育30分钟,然后加入200μg/ml AOPPs分别孵育5、15、30、60分钟,以单纯培养基培养的细胞为正常对照,检测AOPPs诱导细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)生成的时间效应。取同步生长的胰岛,装载荧光探针,而后加入50、100、200μg/ml AOPPs-RSA或200μg/ml RSA孵育30分钟,以单纯培养基培养的细胞为正常对照,检测AOPPs诱导细胞内活性氧(ROS)生成的剂量效应。收集完整细胞,用冷PBS洗3次,流式细胞仪检测细胞荧光强度(488nm激发波长,525nm发射波长),反映细胞内ROS生成量。在阻断实验中,胰岛分别与NADPH氧化酶抑制剂夹竹桃麻素(apocynin) 10μmol/L、胞浆型超氧化物歧化酶C-SOD 200U/ml于37℃预孵育1小时,而后加入AOPPs-RSA、RSA等刺激因素,按上述方法检测细胞内活性氧(ROS)生成量,按胰岛素释放实验步骤检测上清胰岛素含量。5.胰岛RAS系统表达的检测5.1胰岛AT1受体mRNA及蛋白表达胰岛与200μg/ml AOPPs-RSA共同孵育6、12、24小时,以单纯培养基培养的细胞为正常对照,提取细胞总RNA和蛋白,按试剂盒说明进行操作,实时定量PCR和Western Blotting检测AOPPs对AT1受体mRNA和蛋白表达影响的时间效应。胰岛分别与50、100、200μg/ml AOPPs-RSA或200μg/ml RSA共同孵育24小时,以单纯培养基培养的细胞为正常对照,收集细胞,提取细胞总RNA和蛋白,实时定量PCR和Western Blotting检测AOPPs对AT1受体mRNA和蛋白表达影响的剂量效应。5.2.胰岛ACEmRNA表达胰岛与200μg/ml AOPPs-RSA共同孵育6、12、24小时,以单纯培养基培养的细胞为正常对照,提取细胞总RNA,按试剂盒说明进行操作,实时定量PCR检测。AOPPs对ACEmRNA表达影响的时间效应。胰岛分别与50、100、200μg/ml AOPPs-RSA或200μg/ml RSA共同孵育24小时,以单纯培养基培养的细胞为正常对照,收集细胞,提取细胞总RNA和蛋白,实时定量PCR检测AOPPs对ACE mRNA表达影响的剂量效应。5.3胰岛AGTmRNA表达胰岛与200μg/ml AOPPs-RSA共同孵育6、12、24小时,以单纯培养基培养的细胞为正常对照,提取细胞总RNA,按试剂盒说明进行操作,实时定量PCR检测AOPP对AGTmRNA表达影响的时间效应。胰岛分别与50、100、200μg/ml AOPPs-RSA或200μg/ml RSA共同孵育24小时,以单纯培养基培养的细胞为正常对照,收集细胞,提取细胞总RNA和蛋白,实时定量PCR检测AOPPs对AGT mRNA表达影响的剂量效应。5.4胰岛合成AngⅡ的测定胰岛与200μg/ml AOPPs-RSA共同孵育6、12、24小时,以单纯培养基培养的细胞为正常对照,裂解细胞后,ELISA法测定细胞裂解液中AngⅡ含量变化的时间效应。胰岛分别与50、100、200μg/ml AOPPs-RSA或200μg/ml RSA共同孵育24小时,以单纯培养基培养的细胞为正常对照,裂解细胞后,ELISA法测定细胞裂解液中AngⅡ含量变化的剂量效应。6. ACEI和ARB对AOPPs造成的胰岛素分泌变化的影响胰岛分别与血管紧张素转换酶抑制剂(angiotensin converting enzyme inhibitor, ACEI)类药物赖诺普利6mmol/l和血管紧张素拮抗剂(Angiotensin Receptors blocker, ARB)类药物替米沙坦6mmol/l于37℃预孵育,同时加入AOPPs-RSA或RSA共同孵育。按胰岛素释放实验步骤检测上清中胰岛素含量。7.抗氧化剂对AOPP刺激的胰岛RAS系统表达的影响在阻断实验中,胰岛分别与NADPH氧化酶抑制剂夹竹桃麻素(apocynin)10μmol/L和胞浆型超氧化物歧化酶C-SOD 200 U/ml于37℃预孵育1小时,而后加入AOPPs-RSA或RSA共同孵育。检测胰岛细胞内RAS系统的表达。方法同上。8.统计方法所有数据均代表3次重复实验的结果,以均数±标准差表示。所有统计由统计软件SPSS13.0完成。多个样本均数的比较采用One-Way ANOVA,两两比较采用LSD和SNK, P<0.05为有显著差异。结果1.AOPPs对胰岛分泌胰岛素的影响AOPPs-RSA (200μg/ml)与胰岛共同孵育6、12、24小时后,胰岛素释放指数随刺激时间的延长而降低(P<0.05),12h、24h时分别降低34.8%和67.8%。同时,AOPPs以剂量依赖的方式降低胰岛素释放指数(P<0.05),在AOPPs-RSA100ug/ml、AOPPs-RSA200ug/ml时分别下降33.3%和67.5%。2. AOPPs对胰岛氧化应激的影响AOPPs-RSA刺激胰岛后ROS的生成量随刺激时间延长而增加,于30分钟时达高峰(P<0.05)。并且,ROS的生成量随AOPP浓度升高而增加,于200μg/ml时达高峰(P<0.05)。正常RSA与对照组相比,ROS的生成量无显著性差异(P>0.05)。以NADPH氧化酶抑制剂apocynin、胞浆型超氧化物岐化酶C-SOD预处理胰岛细胞,再给予AOPPs-RSA200μg/ml孵育30分钟,流式细胞术检测细胞内DCFH荧光量。结果显示,NADPH氧化酶抑制剂apocynin、及胞浆型超氧化物岐化酶C-SOD均可显著抑制ROS的生成(P值均<0.05),抑制率分别为54.1%和73.6%。为研究氧化应激与胰岛分泌胰岛素功能的关系,本研究用apocynin、C-SOD预处理胰岛细胞,预孵育1小时,再给予AOPPs-RSA 200μg/ml孵育24小时。结果显示,NADPH氧化酶抑制剂apocynin、及胞浆型超氧化物岐化酶C-SOD均可显著增加胰岛素释放指数(P值均<0.05),与AOPPs-RSA 200μg/ml组相比分别增加1.64倍和2.33倍。3. AOPPs对胰岛RAS系统的影响3.1 AOPPs对胰岛AT1RmRNA和蛋白表达的影响AOPPs-RSA (200μg/ml)与胰岛共同孵育6、12、24小时后,AT1R mRNA的表达随刺激时间的延长而增强,呈时间依赖性(P<0.05)。同时,AOPPs以剂量依赖的方式上调AT1R mRNA的表达(P<0.05)。AT1R蛋白的表达也呈同样的规律。正常RSA与对照组相比,AT1R mRNA和蛋白的表达无显著性差异(P>0.05)3.2 AOPPs对胰岛ACEmRNA表达的影响AOPPs-RSA (200μg/ml)与胰岛共同孵育6、12、24小时后,ACE mRNA的表达随刺激时间的延长而增强,呈时间依赖性(P<0.05)。同时,AOPPs以剂量依赖的方式上调ACE mRNA的表达(P<0.05)。正常RSA与对照组相比,ACEmRNA的表达无显著性差异(P>0.05)。3.3 AOPPs对胰岛AGTmRNA表达的影响AOPPs-RSA (200μg/ml)与胰岛共同孵育6、12、24小时后,AGT mRNA的表达随刺激时间的延长而增强,呈时间依赖性(P<0.05)。同时,AOPPs以剂量依赖的方式上调AGT mRNA的表达(P<0.05)。正常RSA与对照组相比,AGTmRNA的表达无显著性差异(P>0.05)。3.4 AOPPs对胰岛AngⅡ合成的影响AOPPs-RSA (200μg/ml)与胰岛共同孵育6、12、24小时后,AngⅡ的合成随刺激时间的延长而增强,呈时间依赖性(P<0.05)。同时,AOPPs以剂量依赖的方式上调AngⅡ的表达(P<0.05)。正常的RSA与正常对照组相比,AngⅡ的表达无显著性差异(P>0.05)。4. ACEI和ARB对AOPPs造成的胰岛素分泌变化的影响为研究RAS系统与胰岛分泌胰岛素功能的关系,本研究用ACEI类抑制剂赖诺普利6mmol/l和ARB类拮抗剂替米沙坦6mmol/l于37℃孵育,同时加入AOPPs-RSA或RSA等刺激因素孵育24小时,ELISA法检测胰岛素含量。结果显示,赖诺普利、替米沙坦均可显著增加胰岛素释放指数(P值均<0.05),与AOPPs-RSA 200μg/ml组相比分别增加1.01倍和1.37倍。5抗氧化剂对AOPPs激活胰岛RAS的影响为探讨氧化应激与RAS系统间的关系,用NADPH氧化酶抑制剂夹竹桃麻素apocynin及胞浆型超氧化物岐化酶C-SOD预处理胰岛细胞,再给予AOPPs-RSA200gg／ml或RSA孵育24小时,结果显示,NADPH氧化酶抑制剂apocynin、及胞浆型超氧化物岐化酶C-SOD均可显著抑制RAS成分的表达(P值均<0.05)。结论AOPPs通过时间和剂量依赖方式减少体外培养的大鼠胰岛分泌胰岛素,其机制可能通过氧化应激介导的RAS系统激活有关。上述结果提示,体内蓄积的AOPPs可能通过活化胰岛RAS造成胰岛功能障碍,参与糖尿病的发病机制。本研究为进一步揭示糖尿病的发病机理提供了新的依据,为这一严重危害人类健康疾病的防治提供了新的干预靶点。