1背景与目的胃癌是人类第四大恶性肿瘤，其死亡率高居世界第二位，仅次于肺癌。中国也是胃癌的高发地区，胃癌目前仍是死亡人数最多的恶性肿瘤之一。因此深刻理解胃癌发生的分子机制对指导治疗十分重要。幽门螺杆菌(Helicobater pylori, H.pylori)是胃癌发生的I类致癌原，胃癌的发生和发展是多种基因共同作用的结果，H.pylori通过怎样的分子机制导致胃癌的发生是研究的重点。研究表明在H.pylori感染所致癌变过程中，凋亡相关基因在胃癌的发生发展过程中可能起到一个关键性的作用。我们的前期临床研究表明H.pylori感染胃粘膜上皮细胞后，可使促凋亡基因Fas相关因子1（Fas associated factor1, FAF1）mRNA表达水平发生变化。H.pylori感染是否通过影响FAF1表达及其相应信号通路促进胃癌的发生和发展，是本课题需验证的设想。通过对胃癌发病机制的进一步阐明，可能为肿瘤的治疗寻找到新的靶基因和抗肿瘤药物，为肿瘤的治疗提供新的方向。2方法2.1荧光定量PCR检测胃黏膜上皮细胞和不同分化程度的胃癌细胞内FAF1mRNA的表达水平。用不同浓度H.pylori NCTC11637与胃黏膜上皮细胞、胃癌细胞共同培养，按细胞/细菌共培养比率分为对照组（未与细菌共培养）、1:100共培养组及1:200共培养组，观察共培养后细胞的形态改变，噻唑蓝检测细胞活力，绘制感染后细胞的生长曲线，流式细胞仪检测凋亡情况，荧光定量PCR检测FAF1基因的表达变化。2.2选择慢病毒载体作为FAF1基因的载体，扩增FAF1cDNA全长基因，将其克隆到AgeⅠ酶切慢病毒载体中， DNA测序鉴定重组克隆，将表达FAF1质粒和慢病毒包装质粒pHelper1.0载体和pHelper2.0及Lipofectamine2000共同转染细胞293T，转染48小时后，收集细胞上清中的表达FAF1病毒颗粒Lenti-FAF1，过滤浓缩，荧光定量PCR法测定病毒滴度。相同的方法构建阴性对照慢病毒颗粒Lenti-NC，荧光定量PCR方法测定慢病毒滴度。2.3用对数生长期的HGC-27细胞转染慢病毒颗粒，实验分为Lenti-FAF1/HGC-27组（转染Lenti-FAF1的HGC-27细胞）及Lenti-NC/HGC-27组（转染阴性对照病毒Lenti-NC慢病毒的HGC-27细胞）及HGC-27组（未转染病毒的HGC-27细胞），将上述细胞用流式细胞仪检测细胞周期及凋亡、噻唑蓝检测细胞增殖活力、克隆形成试验检测细胞成瘤能力。将Lenti-FAF1/HGC-27组、Lenti-NC/HGC-27组及HGC-27组常规消化制成细胞悬液，随机选取6只裸鼠，向每只裸鼠右侧腋下注射1×107个细胞，每天观察裸鼠的全身状况、饮食、体重及运动情况。每3-4d观察皮下肿瘤的生长情况，游标卡尺测量肿瘤的长径和短径，用于制作生长曲线，计算肿瘤体积。28d后颈椎脱臼法处死裸鼠，取瘤体HE染色观察其形态学改变，Western blot及免疫组化SP法进行FAF1蛋白表达的检测。2.4ELISA方法检测Lenti-FAF1/HGC-27组、Lenti-NC/HGC-27组、HGC-27组、Lenti-FAF1/HGC-27组+H.pylori、Lenti-NC/HGC-27组+H.pylori及HGC-27组+H.pylor IL-8及TNF-α蛋白的表达水平，荧光定量PCR及Westernblot检测Lenti-FAF1/HGC-27组、Lenti-NC/HGC-27组、HGC-27组以及Lenti-FAF1/HGC-27组+H.pylori FAF1及NF-κB途径重要蛋白p65及Iκκβ的表达水平。3结果3.1幽门螺杆菌对人胃黏膜上皮细胞FAF1表达影响：3.1.1各细胞FAF1mRNA的表达水平：与细胞GES-1FAF1mRNA相对表达量1.04±0.23相比，细胞HGC-27的相对表达量0.36±0.19和SGC-7901的相对表达量0.52±0.17明显降低（P<0.05），HGC-27细胞FAF1mRNA相对表达量低于SGC-7901细胞（P <0.05）。3.1.2幽门螺杆菌与细胞共培养24h后，死亡细胞增多，可见“蜂鸟”表型，H.pylori抑制细胞增殖，促进细胞凋亡。3.1.3幽门螺杆菌共培养后对细胞FAF1mRNA表达的影响：与各自对照组相比，FAF1mRNA在HGC-27细胞1:100和1:200共培养组表达量明显降低（0.67±0.20vs0.99±0.27，P<0.05；0.44±0.30vs0.99±0.27，P<0.001）；SGC-7901细胞FAF1mRNA在1:100共培养组与1:200共培养组的相对表达量明显减低（0.72±0.29vs1.05±0.42，P<0.05；0.47±0.31vs1.05±0.42，P<0.003）。在GES-1细胞1:100共培养组表达量明显升高（1.61±0.77vs0.99±0.41， P<0.013），1:200共培养组表达量明显降低（0.36±0.22vs0.99±0.41，P<0.011）。与各自1:100共培养组相比，FAF1mRNA在HGC-27及SGC-7901细胞1:200共培养组表达量无统计学差异（P>0.05），在GES-1细胞1:200共培养组表达量明显降低（P<0.001）。3.2重组FAF1慢病毒表达载体的构建与鉴定：3.2.1FAF1扩增产物全长为1996bp，重组FAF1-GV218质粒酶切产物长度为724bp，经测序证实与预期序列一致。将FAF1-GV218质粒及阴性对照质粒转染293T细胞进行病毒包装48h后，荧光显微镜下见绿色荧光产生，病毒包装成功。3.2.2Real time PCR测定重组FAF1慢病毒（Lenti-FAF1）的滴度为2×108TU/mL，阴性对照病毒（Lenti-NC）的滴度为3×109TU/mL。3.3慢病毒介导的FAF1高表达对人胃癌细胞HGC-27在体内及体外的影响：3.3.1细胞形态改变：转染Lenti-FAF148h后，HGC-27细胞由贴壁长梭形上皮样细胞形态变得不规则，Lenti-NC/HGC-27组细胞形态无明显改变。3.3.2对转染细胞FAF1表达的影响：与Lenti-FAF1/HGC-27组表达量(2.436±0.538)相比， FAF1mRNA在HGC-27组（1.086±0.226）和Lenti-NC/HGC-27组（1.182±0.381）的相对表达水平明显降低（P<0.001）；HGC-27组和Lenti-NC/HGC-27组FAF1mRNA表达量无统计学差异。与Lenti-FAF1/HGC-27组表达量（1.515±0.377）相比，FAF1蛋白在HGC-27组（0±0）和Lenti-NC/HGC-27组（0±0）的相对表达量明显降低（P<0.001）；重组FAF1慢病毒构建成功。3.3.3对转染细胞增殖、凋亡、克隆形成率的影响：从细胞生长第2天开始，Lenti-FAF1/HGC-27组细胞增殖活力低于HGC-27组及Lenti-NC/HGC-27组(P<0.05)。G2/M期Lenti-FAF1/HGC-27组细胞数明显高于HGC-27组(29.78%±3.91%vs19.33%±3.82%， P<0.05)及Lenti-NC/HGC-27组（29.78%±3.91%vs20.93%±2.46%，P<0.05)。Lenti-FAF1/HGC-27组凋亡率显著高于HGC-27组（84.66%±5.92%vs4.60%±3.80%，P<0.001）和Lenti-NC/HGC-27组（84.66%±5.92%vs7.32%±3.82%， P<0.001）。Lenti-FAF1/HGC-27组的克隆形成率较HGC-27组（45.75%±5.73%vs62.5%±11.25%， P<0.05）及Lenti-NC/HGC-27组（45.75%±5.73%vs56.75%±8.57%，P<0.05）明显减低。3.3.4对转染细胞体内成瘤能力的影响：Lenti-FAF1/HGC-27组裸鼠皮下移植肿瘤体积生长缓慢，从接种第8天开始体积明显低于HGC-27组及Lenti-NC/HGC-27组(P<0.05)。HE染色示HGC-27组和Lenti-NC/HGC-27组细胞异型性明显,核分裂相多见;而Lenti-FAF1/HGC-27组异型性较低,核分裂相少见。免疫组化SP法显示Lenti-FAF1/HGC-27组肿瘤组织的FAF1阳性细胞表达率和染色强度与HGC-27组和Lenti-NC/HGC-27组相比明显升高（P<0.05）。免疫印迹法显示Lenti-FAF1/HGC-27组FAF1蛋白相对表达量（0.87±0.34）与HGC-27组（无表达）及Lenti-NC/HGC-27组（无表达）相比明显升高(P<0.05)。3.4幽门螺杆菌对胃癌细胞FAF1的影响及相关通路研究：3.4.1IKKβ基因：与Lenti-FAF1/HGC-27组相比，IKKβ mRNA在HGC-27组（0.95±0.10vs0.50±0.06，P<0.05）、Lenti-NC/HGC-27组（0.87±0.07vs0.50±0.06， P<0.05）及Lenti-FAF1/HGC-27组+H.pylori （0.75±0.12vs0.50±0.06，P<0.05）的相对表达量明显升高；与Lenti-FAF1/HGC-27组+H.pylori相比，IKKβ mRNA在HGC-27组及Lenti-NC/HGC-27组的表达水平明显升高（P<0.05）。与Lenti-FAF1/HGC-27组相比，IKKβ蛋白在HGC-27组（0.11±0.04vs0.03±0.02，P<0.05）、Lenti-NC/HGC-27组（0.10±0.08vs0.03±0.02，P<0.05）及Lenti-FAF1/HGC-27组+H.pylori组（0.08±0.03vs0.03±0.02，P<0.05）相对表达量明显升高；与Lenti-FAF1/HGC-27组+H.pylori相比，IKKβ蛋白在HGC-27组及Lenti-NC/HGC-27组的相对表达量明显升高（P<0.05）。3.4.2p65基因：与Lenti-FAF1/HGC-27组相比，p65mRNA在HGC-27组（0.96±0.05vs0.32±0.10，P<0.05）、Lenti-NC/HGC-27组（0.90±0.03vs0.32±0.10， P<0.05）及Lenti-FAF1/HGC-27组+H.pylori （0.50±0.10vs0.32±0.10，P<0.05）的相对表达量明显升高。与Lenti-FAF1/HGC-27组+H.pylori相比，p65mRNA在HGC-27组及Lenti-NC/HGC-27组的相对表达量明显升高（P<0.05）。与Lenti-FAF1/HGC-27组相比，p65蛋白在HGC-27组（0.64±0.13vs0.14±0.03，P<0.05）、Lenti-NC/HGC-27组（0.49±0.06vs0.14±0.03， P<0.05）及Lenti-FAF1/HGC-27组+H.pylori （0.28±0.02vs0.14±0.03，P<0.05）的相对表达量较明显升高；与Lenti-FAF1/HGC-27组+H.pylori相比，p65蛋白在HGC-27组及Lenti-NC/HGC-27组的相对表达量明显升高（P<0.05）。3.4.3FAF1基因：与Lenti-FAF1/HGC-27组相比，FAF1mRNA在HGC-27组（1.086±0.226vs2.436±0.538，P<0.05）、Lenti-NC/HGC-27组（1.182±0.381vs2.436±0.538，P<0.05）及Lenti-FAF1/HGC-27组+H.pylori（1.75±0.12vs2.436±0.538，P<0.05）的相对表达量明显降低；与Lenti-FAF1/HGC-27组+H.pylori相比，FAF1mRNA在HGC-27组及Lenti-NC/HGC-27组相对表达量明显降低（P<0.05）。与Lenti-FAF1/HGC-27组相比，FAF1蛋白在HGC-27组（0±0vs1.515±0.377P<0.05）、Lenti-NC/HGC-27组（0±0vs1.515±0.377P<0.05）及Lenti-FAF1/HGC-27组+H.pylori组（0.76±0.24vs1.515±0.377, P<0.05）的相对表达量明显降低（P<0.05），与Lenti-FAF1/HGC-27组+H.pylori相比， FAF1蛋白在HGC-27组及Lenti-NC/HGC-27组的相对表达量明显降低（P<0.05）。3.4.4IL-8及TNF-α的测定：在H.pylori共培养后，细胞上清中IL-8及TNF-α的含量均升高，与Lenti-FAF1/HGC-27组+H.pylori相比，Lenti-NC/HGC-27组+H.pylori及HGC-27组+H.pylori TNF-α、IL-8的表达明显升高（P<0.05）。4结论4.1FAF1基因在胃癌细胞系中表达低于正常胃黏膜上皮细胞；FAF1基因的表达水平可能与胃癌细胞的分化程度有关，提示FAF1基因在胃癌细胞的分化和生存中发挥了重要作用。H.pylori感染胃黏膜上皮细胞后可以下调FAF1基因的表达水平，幽门螺杆菌感染所导致细胞增殖与凋亡紊乱的分子机制之一，可能是通过干扰FAF1表达实现的。4.2成功构建Lenti-FAF1及Lenti-NC，为下一步实验提供了必要手段。4.3转染Lenti-FAF1后，胃癌细胞HGC-27FAF1mRNA和蛋白表达明显上调。转染Lenti-FAF148h后，HGC-27细胞的形态发生改变，由长梭形变为不规则形，有可能提示细胞凋亡的开始。FAF1高表达可以抑制胃癌细胞增殖、促进细胞凋亡，抑制胃癌细胞克隆形成率，导致胃癌细胞周期阻滞在G2/M期。FAF1高表达可以抑制裸鼠皮下移植瘤的生长，减低胃癌细胞的异型性及恶性程度，提示FAF1基因在胃癌发生发展过程中起重要作用。4.4FAF1高表达能减少H.pylori感染炎症因子IL-8及TNF-α的表达水平，能显著减少NF-κB信号通路p65及Iκκβ的表达，H.pylori感染可以通过降低FAF1的表达，上调p65及Iκκβ的表达，提示H.pylori可下调NF-κB信号通路负调节基因FAF1的表达发挥其致癌作用。创新点FAF1与胃癌的关系目前国内外研究较少，从细胞水平探讨其对胃癌发生发展过程的影响及其与H.pylori的关系的相关研究未见报道。本课题首先证实了胃癌细胞系HGC-27及SGC-7901，正常胃黏膜上皮细胞系GES-1FAF1mRNA的表达情况，FAF1的表达水平可能与细胞分化程度有关，幽门螺杆菌可以下调FAF1基因的表达水平。成功构建了重组FAF1慢病毒表达载体及高表达FAF1的稳定转染细胞株，发现了FAF1高表达可以抑制胃癌细胞增殖，促进细胞凋亡，减少细胞克隆形成率，阻滞胃癌细胞于G2/M期，降低胃癌细胞体内成瘤能力，初步阐明幽门螺杆菌及FAF1表达在胃癌生长中相关的通路机制，为FAF1作为胃癌治疗的靶基因提供理论及实验依据。