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研究背景脓毒症(Sepsis)是指感染引起的全身炎症反应综合症,是临床上一种常见且较难治疗的综合征。脓毒症具有发病率高、死亡率高及医疗负担重等特点,全球每年有超过1800万严重脓毒症病例,死亡率高达30-50%,是重症监护室(Intensive Care Unit,及ICU)患者的主要死因之一。脓毒症的发病机制十分复杂,其中感染和炎症反应在脓毒症的发生发展中起着至关重要的作用。在脓毒症早期阶段,感染引起促炎症介质的大量释放,并由此导致严重的组织器官损伤,其中肺脏是脓毒症的首位受累靶器官。若病情得不到及时控制,机体由免疫功能亢进转为免疫功能抑制,使得原发病原微生物和机会感染菌大量繁殖,最终导致患者死亡。巨噬细胞作为机体固有免疫系统中的重要效应细胞在免疫监视及防御中发挥着关键作用。病原体可诱发巨噬细胞分泌多种生物活性物质,如NO、TNF-α、ROS等,其中ROS作为第二信使参与细胞信号传导,是重要的免疫调节因子。细胞内适宜浓度的ROS可干扰细菌的DNA转录和三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)合成,杀灭病菌或破坏细胞膜、干扰酶的功能,从而清除微生物。尽管以TLRs为首的模式识别受体及其介导的信号转导通路在脓毒症的发病机制中占据十分重要的地位,但近些年来的研究发现针对TLRs为靶向的脓毒症治疗并未取得理想效果。S1P受体(Sphingosine 1-phosphate receptor, S1PRs)是一类G蛋白偶联受体,与磷酸分子1-磷酸硝胺醇(Sphingosine 1-phosphate, SIP)结合,启动细胞跨膜信号转导效应,介导S1P发挥其第一信使作用,调节细胞增殖,血管生成和炎症反应。S1PR3作为S1PRs家族中一个主要成员,它与三种G蛋白发生偶联(Gi、Gq、G12/G13),介导了广泛的生物学效应。当前,对S1PR3调控中枢及外周固有免疫细胞促炎作用的研究较为广泛,而其在病原微生物清除中的作用并不明确。研究目的本研究旨在通过第一部分：设计合成S1PR3特异性激动剂KRX-725,建立腹腔细菌感染脓毒症模型,并特异性干预S1PR3功能,分析STPE3对脓毒症小鼠生存率,细菌复合及肺脏损伤的影响。第二部分：体外观察KRX-725对巨噬细胞产生活性氧(ROS)的调节作用,对巨噬细胞细菌清除功能的影响。探讨S1PR3参与细菌清除的功能及其分子机制。研究方法采用大肠杆菌(E.coli)腹腔注射小鼠诱导脓毒症模型。并采用S1PR3特异性激动剂KRX-725于建模后进行腹腔注射治疗,对照组给予等体积的溶剂。两组分别于治疗后第8、16、24、32、40、48小时,观察脓毒症小鼠生存率情况。KRX-725治疗组及对照组分别于脓毒症模型后24h,取外周血及腹腔灌洗液,按比例进行梯度稀释,LB平板培养过夜,计算出每毫升血液或腹腔灌洗液细菌集落数(colony forming units, CFU).并于建模后24小时取肺脏组织,固定、制作石蜡切片及HE染色,进行肺损伤评分。体外Fluid Thioglycollate Medium诱导小鼠腹腔巨噬细胞,按比例应用E.coli刺激小鼠巨噬细胞,时间分别为0 min,10min,20min,30min,40min,50min和60min,刺激结束后,检测ROS水平。用同样方法所得的腹腔巨噬细胞,进行庆大霉素保护实验。实验数据使用SPSS17.0软件做统计学分析,生存率分析采用Log-rank Test,计量资料采用均数±标准差(mean±SD)表示,组间数据比较采用独立样本T检验分析,P<0.05为差异有统计学意义。研究结果1. 小鼠腹腔注射大肠杆菌,成功诱导脓毒症模型,KRX-725治疗组脓毒症小鼠(n=12)生存率显著高于对照组(n=12),差异具有统计学意义(P<0.05)。2. 在KRX-725干预后24小时,KRX-725治疗组(n=5)每毫升血液中的CFU值显著低于对照组(P<0.05),两组的腹腔灌洗液CFU值差异更为显著(P<0.01)。3. 在KRX-725治疗后24h进行观察(n=3),对照组有典型的急性肺损伤的组织学改变,包括肺泡充血、大量炎性细胞渗出浸润、弥漫性肺泡损伤等,而KRX-725治疗组肺损伤的组织学变化明显减轻,其急性肺损伤评分也显著低于对照组,差异具有统计学意义(p<0.05)。4. E.coli体外刺激巨噬细胞,检测细胞内ROS的水平,KRX-725治疗组活性氧(ROS)的水平在第20min时明显高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05),在第30min时差异最为显著(P<0.01)。5. 庆大霉素保护实验结果,KRX-725治疗组细胞内的细菌存活数明显低于对照组(p<0.05),6小时两组之间的差异更为显著(p<0.01)。研究结论体内研究发现,S1PR3特异性激动剂KRX-725可显著改善脓毒症小鼠生存率,并降低脓毒症小鼠24小时腹腔及血液细菌负荷,减轻肺脏损伤。体外研究发现,S1PR3特异性激动剂通过上调巨噬细胞中活性氧(ROS)的水平,增强细胞清除细菌的能力,改善脓毒症预后。该研究结果不仅为S1PR3在脓毒症的早期防治机制的作用提供新的见解,也为脓毒症和其他感染性疾病提供新的潜在的治疗靶点。