【摘 要】
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猪流行性腹泻病毒（PEDV）是RNA病毒,归属于冠状病毒属,与感染人体的非典冠状病毒及猪胃肠炎病毒（TGEV）有着较高的相似性。猪首次感染PEDV时,可能出现急性腹泻的情况,粪便为含有腥臭气味的绿色或灰色的喷射状物,一定比例的病猪会出现呕吐现象。哺乳仔猪病死率较高,在出现严重脱水的情况下可能导致死亡;成年后的猪病死率较低,但发病率较高,并且具有较强的传染性。母猪康复后自身会产生对应的抗体从而保护仔
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猪流行性腹泻病毒（PEDV）是RNA病毒,归属于冠状病毒属,与感染人体的非典冠状病毒及猪胃肠炎病毒（TGEV）有着较高的相似性。猪首次感染PEDV时,可能出现急性腹泻的情况,粪便为含有腥臭气味的绿色或灰色的喷射状物,一定比例的病猪会出现呕吐现象。哺乳仔猪病死率较高,在出现严重脱水的情况下可能导致死亡;成年后的猪病死率较低,但发病率较高,并且具有较强的传染性。母猪康复后自身会产生对应的抗体从而保护仔猪。在早期被PEDV感染的猪中,PEDV N蛋白的抗体水平是产生最高的。并且,基因中保守性最高的也是N基因,因此N蛋白是建立PEDV分子诊断方法的优选目标蛋白。鉴于此,本研究利用大肠杆菌表达PEDV（HUB2018株）分离株N蛋白,将表达成功并纯化好的PEDV N蛋白经三次皮下注射免疫BALB/c小鼠,完成了单克隆抗体的制备,获得的单克隆抗体可为更深层的研究PEDV的致病机理、建立快速高通量的诊断检测试剂盒,如ELISA、IFA和胶体金试纸条等奠定基础。主要研究内容及结果如下:1.PEDV（HUB2018株）N基因的克隆与原核表达采用RT-PCR法对PEDV HUB2018毒株N基因进行扩增,扩增出与预期长度1326 bp大小一致的目的条带。将PEDV-N基因克隆至质粒PET-30a（+）,构建了重组质粒PET-30a（+）-PEDV-N。重组质粒PET-30a（+）-PEDV-N在BL-21大肠杆菌表达菌株中经1m M的IPTG诱导后成功表达,获得分子量与预期融合蛋白58k Da大小一致、并带His标签的融合蛋白。经蛋白纯化,所得纯化的PEDV N蛋白浓度为7.127mg/m L。Western blot结果表明其也可分别与His标签抗体、PEDV猪阳性血清发生特异性抗体反应。2.PEDV N蛋白间接酶联免疫吸附试验（ELISA）抗体检测方法的建立将已纯化出来的PEDV N蛋白作为包被的抗原,研究构建出了间接的特异性ELISA抗体反应的检测技术方法。各反应物浓度、环境温度及作用时间经优化后确定如下:抗原的最佳包被浓度为0.5μg/m L;最佳的抗原包被时间为4℃作用9-12 h;最佳封闭液为1%BSA,37℃,封闭时间为2 h;血清样品的最佳稀释度比例为1:160,37℃作用下1 h;羊抗猪酶标二抗的最佳稀释度之比为1:9000,37℃作用1 h。3.PEDV（HUB2018株）N蛋白单克隆抗体的制备将纯化好且纯度高的PEDV N蛋白与弗氏完全佐剂（第一次免疫）和弗氏不完全佐剂（第二次、第三次免疫）一起进行乳化,乳化后以其为免疫原皮下注射免疫小鼠,选取免疫小鼠最佳的标准是6-8周龄的雌性BALB/c小鼠。在一个月内,经三次免疫后,需对小鼠进行血清抗体水平的检测,以确保免疫小鼠满足细胞融合实验的要求。在实验室严格无菌环境条件下,将免疫三次小鼠的脾细胞取出并与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合。用前述PEDV N蛋白间接ELISA抗体检测方法筛选阳性细胞株,经历3轮连续的有限稀释法筛选,获得1株有着较高特异性抗体水平的阳性细胞株,经Western blot验证后,获得1株杂交瘤细胞,该株杂交瘤细胞的特异性抗体水平高并且可以稳定地分泌,将其命名为E5-E5。4.PEDV（HUB2018株）N蛋白单克隆抗体的鉴定收集培养的杂交瘤细胞上清液,通过Western blot实验证实其上清液可与PEDV N蛋白结合发生特异性反应。间接免疫荧光（IFA）实验证实,PEDV N蛋白单克隆抗体能与PEDV湖北分离株（HUB2018）全病毒发生特异性反应且特异性良好。对杂交瘤细胞进行了亚型鉴定和染色体计数。亚型鉴定结果显示其重链类型为Ig G1,轻链类型为Kappa。该株杂交瘤细胞染色体数约100-110对。5.PEDV（HUB2018株）N蛋白单克隆抗体的大量制备雌性BALB/c小鼠的腹腔内注射E5-E5杂交瘤细胞,用来进行腹水的大量制备,收集小鼠腹水样品后进行抗体效价的测定。结果表明该单抗的效价为1:102400。综上所述,本研究成功制备抗PEDV N蛋白单克隆抗体,为后续PEDV致病机理研究、建立诊断检测试剂盒等奠定基础。
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