背景和目的耳鼻喉门诊有约10%的患者存在咽喉反流性疾病(Laryngopharyngeal Reflux Disease,LPRD),50%的声音嘶哑与咽喉反流相关。由于LPRD的症状和体征均无特异性,引发了目前LPRD诊断的困境。24小时喉咽pH监测技术曾被认为是诊断LPRD的诊断金标准,但它诊断仍沿用胃食管反流疾病(Gastroesophageal Reflux Disease,GERD)的标准,将pH<4的次数和时间百分比作为诊断LPRD的参数,而咽喉部位以大于4的弱酸反流为主,极少出现低于4的反流,使得该法诊断LPRD的敏感度低,漏诊率高。与喉咽pH监测比较,唾液胃蛋白酶(Pepsin)被认为是目前最有前景的LPRD诊断方法,但诊断特异性不高,因为正常人存在一定程度生理性反流,该法在诊断LPRD上缺乏统一 Cutoff值。本文紧紧围绕Pepsin与LPRD,探究咽喉pH环境、唾液pepsin对LPRD的诊断意义、LPRD患者组织Pepsin的表达,为Pepsin相关的诊断LPRD方法完善临床理论依据。对象和研究方法研究对象于2018年10月至2019年11月因存在咽喉反流相关疾病(包括慢性喉炎、声带息肉、后联合肉芽肿、任克氏间隙水肿、声带不典型增生、声带白斑、声带癌)于南方医科大学南方医院耳鼻咽喉科就诊且需手术的患者共79例,完善纤维电子喉镜、反流症状量表(RSI)、反流体征量表(RFS)、24小时Dx-pH检查同时留取5个不同时间节点唾液;按Ryan值立位>9.41、卧位>6.8确诊为LPRD的患者共21例,其中留取了室带组织的LPRD患者17例;LPRD患者无气道、消化道解剖变异,无手术或基础疾病史,近期无吸烟或酗酒史,近期无PPI类药物服用史等。于2016年06月至2017年12月由南方医科大学南方医院耳鼻咽喉科招募健康志愿者,无咽喉反流相关症状,喉镜检查无急性炎症,无基础疾病史,无PPI类药物服用史;完善24小时Dx-pH检查、RSI、RFS、留取5个不同时间节点唾液及留取少许室带粘膜组织。本研究经南方医科大学南方医院伦理委员会批准,所有入组对象知情并同意参与研究。研究方法1.量表收集将纳入对象依次分别填写反流症状量表(RSI)及反流体征量表(RFS)。2.24小时口咽pH监测采用美国Retech公司的Dx-pH监测系统,连接好设备,确认设备可正常运行后,将电极探头端自单侧前鼻孔置入,将探头放置于口咽部悬雍垂上下约0.5cm处,外固定电极于一侧面颊部;嘱患者按实际情况记录进食、卧位及症状出现的时间,24小时监测结束后,拆除机器;按Date View V3版软件分析数据,输出动态口咽pH波形图、相关pH参数及Ryan指数。3.唾液pepsin检测将收集的唾液自液氮中取出,阶梯复温至4℃,于4℃离心机中离心15min(1000rpm),分离出上清50ul备用。采用武汉Cloud-Clone公司的人胃蛋白酶检测试剂盒(CEA632Hu),检测各唾液标本pepsin浓度。4.室带组织pepsin免疫组化染色将室带粘膜组织进行固定、脱水及包埋,制成组织蜡块,将组织蜡块进行切片,后将切下的组织蜡片进行脱蜡、抗原修复、内源性过氧化物酶阻断、血清封闭、抗体孵育、DAB显色、复染、透明、封皮等步骤,将室带pepsin免疫组化结果进行判读;按照鳞状上皮细胞胞浆内显色深浅进行显色程度评分,无显色为阴性记0分,浅褐色为弱阳性记1分,棕褐色为阳性记2分,颗粒状深棕褐色为强阳性记3分;按显色组织显色比例评分:显色低于25%记1分,显色25%～50%为2分,显色51%～75%记为3分,显色大于75%记为4分;按照显色程度及显色比例乘积将表达程度分为四个等级,0分为阴性记做0级,1-4分为弱阳性记做1级,5-8分为阳性记做2级,9-12分为强阳性记3级。5.统计学分析采用SPSS 20.0版本进行数据处理,计量资料符合正态分布采用t检验,不符合正态分布采用非参数检验;计数资料采用百分比或者率描述,采用卡方检验或者Fisher精确概率法检验。检验水平P<0.05有统计学意义。结果1.LPRD患者口咽pH变化LPRD组患者口咽最小pH值显著低于正常对照组,LPRD组患者最小pH值均值为4.04±1.18,而正常对照组最小pH值均值为5.85±0.164;当口咽pH基线分别设置为6.5、6、5.5或5时,LPRD组患者在反流暴露总时间和反流暴露时间百分比均显著超过正常对照组;口咽pH在≤5、(5,5.5]、(5.5,6]三个区间,LPRD组患者反流暴露总时间明显长于正常对照组。2.LPRD患者不同时间节点唾液pepsin浓度变化相同个体同天不同时间节点唾液中pepsin浓度波动较大,以晨起初觉醒时的唾液pepsin浓度最高;LPRD组患者在晚餐后1小时和晚睡前30分钟这两个时间节点的唾液pepsin浓度值与正常对照组存在显著的统计学差异(P<0.05);晚餐后1小时的唾液取样诊断LPRD的效能显著高于睡前30分钟;晚餐后1小时的唾液pepsin浓度最优的cutoff值为2.11ng/ml,该界值时诊断LPRD的敏感度为76.2%,特异度为100%。3.LPRD患者室带组织中Pepsin表达情况LPRD患者室带组织Pepsin表达程度与正常对照组具有统计学差异(P<0.05),LPRD患者室带粘膜组织Pepsin表达阳性率显著高于正常对照组;LPRD患者室带粘膜Pepsin表达阳性率为100%,其中强阳性占23.5%、阳性占41.1%、弱阳性占35.2%、无阴性表达;正常对照组室带粘膜组织Pepsin表达阳性率为18.2%,其中弱阳性占18.2%、阴性占81.8%、无强阳性及阳性表达。结论1.LPRD患者较正常对照组口咽部存在更长时间的pH低于6的弱酸暴露。2.5个不同时间节点的唾液中,以晨起初觉醒时的唾液pepsin浓度最高;晚餐后1小时的唾液pepsin浓度最优的cutoff值为2.1 1ng/ml。3.正常人室带组织存在Pepsin表达;LPRD患者室带Pepsin表达水平更高,建议将室带组织中阳性(++)Pepsin表达作为诊断LPRD的Cutpoint,可获得理想的诊断特异度。