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目的:通过体外实验观察沙利度胺对人神经胶质瘤细胞U251增殖及对缺氧诱导因子HIF–1、血管内皮生长因子VEGF和对钙离子Ca2+浓度的影响,进一步阐明沙利度胺抗肿瘤、抗血管生成和诱导肿瘤细胞凋亡的作用机制,同时观察沙利度胺联合顺铂对U251细胞的作用。方法:1、选取人神经胶质瘤U251细胞系进行体外培养,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测沙利度胺不同浓度组(10、25、50、100μg/ml)、不同时间组(24、48、72h)对U251细胞存活和生长的影响情况。流式细胞仪测定沙利度胺对U251细胞周期分布和凋亡的影响。2、根据MTT的结果,设置对照及实验组,分别提取各组细胞总RNA,鉴定其完整性及含量,通过逆转录-聚合酶链反应(revers transcription PCR,RT-PCR)半定量检测沙利度胺处理前后U251细胞中HIF–1和VEGFmRNA的表达水平。采用流式细胞术(flow cytometry,FCM)定量检测沙利度胺处理前后U251细胞周期分布和凋亡及对HIF– 1和VEGF蛋白表达的影响。3、采用MTT比色法检测沙利度胺与抗癌药物顺铂联合应用后对U251细胞的增殖抑制作用,测定其吸光度(OD)值,并采用isobolanalysis公式分析相互作用指数(Iteraction Index),评价两药联合后的作用,如相互作用指数>1为两药拮抗作用;相互作用指数=1为两药相加作用;相互作用指数<1为两药协同作用。4、利用激光共聚焦显微镜观察沙利度胺不同浓度组(10、25、50、100μg/ml)作用72h后U251细胞中Ca2+荧光强度的变化。结果:1、MTT结果显示:沙利度胺在(10～100)μg/ml浓度范围内能明显抑制U251细胞体外增殖,随着时间、浓度增加抑制率相应升高,以100μg/ml组作用72h抑制率最高。与对照组相比,不同浓度组对U251细胞抑制率差异均具有显著性统计学意义(P<0.01)。沙利度胺处理细胞48、72h,IC50分别为51.62μg/ml、35.76μg/ml。流式细胞仪检测U251细胞周期分布和凋亡显示,10、25、50、100μg/ml沙利度胺作用U251细胞72h,随药物浓度增大, G0/G1期细胞逐渐增多; S期、G2/M期细胞则逐渐减少。即沙利度胺可阻滞U251细胞周期进程于G1期,该作用呈剂量-效应依赖关系。10、25、50、100μg/ml沙利度胺处理细胞72h后,出现典型的亚二倍体凋亡峰,依沙利度胺浓度增大而逐渐升高;凋亡百分率分别为:9.31 %、14.53%、19.36%、28.30%,较对照组有显著性统计学意义(P<0.01)。2、半定量RT-PCR检测结果显示:沙利度胺不同浓度组处理U251细胞72h后,HIF–1和VEGF mRNA都有不同程度的降低。100μg/ml沙利度胺浓度组作用72h对U251细胞HIF– 1和VEGF mRNA表达抑制最显著,比较沙利度胺处理前HIF–1和VEGFmRNA表达水平差异具有显著性统计学意义(P<0.01)。流式细胞术检测结果显示:0、10、25、50、100μg/ml沙利度胺处理U251细胞72h后U251细胞中HIF–1蛋白表达荧光指数(FI值)分别为1.719、1.645、1.329、1.202、1.081,VEGF蛋白表达荧光指数(FI值)分别为2.248、1.976、1.553、1.337、1.097。比较处理组和对照组的FI值,差异具有统计学意义(P<0.05)。以100μg/ml、72h对HIF– 1和VEGF抑制最显著,与RT-PCR结果一致。3、MTT比色法分析沙利度胺联合顺铂对U251细胞的增殖抑制作用,结果显示:沙利度胺可加强顺铂对U251细胞的增殖抑制作用。在10～100μg/ml范围内,随沙利度胺浓度的增大,其对顺铂的协同作用增强。单用顺铂的IC50为22.31μg/ml,联合10、25、50μg/ml沙利度胺后可将顺铂的IC50分别降低至9.62、4.68、2.41μg/mlμg/ml。因此,在一定浓度范围内,沙利度胺可协同顺铂抑制U251细胞的生长增殖。4、Isobolanalysis分析相互作用指数显示,沙利度胺联合顺铂在细胞生长抑制率为50%时的相互作用指数为0.86,证明沙利度胺确实可协同顺铂对U251细胞的增殖抑制作用。5、激光共聚焦显微镜检测结果示:沙利度胺在10～100μg/ml浓度范围内能明显使U251细胞内Ca2+荧光强度逐渐增强,即钙离子逐渐浓度升高,且随着沙利度胺浓度增加Ca2+浓度相应升高,以100μg/ml组作用72h后细胞中Ca2+荧光强度最高。结论:1、本实验证实在一定浓度范围内,沙利度胺能够抑制U251胶质瘤细胞增殖,并呈浓度-时间依赖关系。2、沙利度胺可阻滞胶质瘤细胞U251于G1期并可诱导该细胞凋亡,诱导细胞凋亡是其抗肿瘤作用机制之一。3、一定浓度的沙利度胺能够在mRNA和蛋白水平抑制U251细胞中HIF– 1和VEGF表达。4、沙利度胺可以使U251细胞内Ca2+浓度升高,证明其具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用。5、沙利度胺可协同顺铂对U251细胞的增殖抑制作用。6、本实验证实了沙利度胺具有抗胶质瘤的作用,并通过沙利度胺联合顺铂的研究丰富了胶质瘤的治疗,为胶质瘤的综合治疗提供了新的理论依据。