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研究目的：构建含人前脑啡肽原基因(hPPE)的重组慢病毒载体,使其转染人胚胎肾细胞(HEK293),获得高效、稳定表达目的基因的细胞株并鉴定hPPE基因的表达情况。为后续转染人前脑啡肽原基因的HEK293细胞用于大鼠癌痛模型的生物镇痛研究提供实验材料。并为日后继续探讨内源性脑啡肽对慢性疼痛及癌性疼痛的治疗实验研究做好平台基础工作。研究方法：将本实验小组构建保存的重组质粒pcDNA3.1/hPPE经限制性内切酶Hind III,Not I剪切后获得hPPE基因片段,根据GenBank数据库中记载的hPPE基因序列设计均含有EcoR I酶切位点的上下游引物,通过PCR技术对目的基因进行扩增。用限制性内切酶EcoR I对表达载体(pLV-UbC-GFP-3FLAG)进行酶切,酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后回收线性化的载体。将扩增的目的基因片段与线性化的表达载体,通过运用基因重组技术进行连接,转化大肠杆菌(E.coli)感受态细胞,鉴定转化子,接种阳性克隆,保存并送测序。测序结果无误的,进行接种抽提目的基因表达质粒。将含有目的基因的表达载体(pLV-UbC-hPPE-GFP), pCD包装质粒,pLTR-G膜蛋白表达质粒共同转染HEK293细胞进行慢病毒包装、扩增、纯化,再将重组的慢病毒载体转染HEK293细胞。用Western blot免疫印迹法检测hPPE基因在转染后的HEK293细胞中的蛋白表达情况。研究结果：1.目的基因(hPPE) PCR扩增后得到DNA产物大小为838bp,经琼脂糖凝胶电泳可显示清晰明亮的条带。纯化的目的基因片段与线性化的表达载体进行连接,转化,菌落PCR鉴定,阳性克隆测序,结果表明：和GenBank数据库中记录的hPPE基因序列比对结果完全一致,说明成功构建了重组慢病毒表达载体。2.重组目的基因表达载体和空表达载体分别与pCD包装质粒,pLTR-G膜蛋白表达质粒共同转染HEK293细胞,转染后第二日可见所有细胞健康且密度接近60%-80%。经慢病毒的包装、纯化后,根据病毒滴度公式计算得到病毒滴度为3.39×108TU/ml。3.HEK293细胞感染UbC-hPPE-GFP-L.V.后,在荧光显微镜下未见到GFP荧光。HEK293细胞感染Ubc-GFP-L.V.空病毒后,可以看出细胞发出较强的荧光,感染率通过观察荧光显微镜下细胞中显现出绿色荧光蛋白的阳性率来表示,可达到100%。4.通过蛋白质免疫印迹法(Western Blot)检测转染后的HEK293细胞样品以及传代至第15代的HEK293细胞样品,均可以观察到阳性条带位于略大于55KDa处有,其大小和hPPE-GFP-FLag融合蛋白(29KDa+28KDa+2KDa=59KDa)相吻合,可以判断hPPE在HEK293细胞中稳定表达。研究结论：本研究成功构建了含有hPPE基因的重组慢病毒载体,使hPPE基因可以稳定表达于HEK293细胞中,为进一步关于脑啡肽物质在疼痛治疗中的应用研究奠定了基础。