肝细胞肝癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）简称肝癌，是世界范围内最常见的消化系统恶性肿瘤之一，恶性程度极高，发病存在逐年增高的趋势。我国是HCC高发国家，肝癌死亡率处于恶性肿瘤的第2位。究其原因，主要与HCC的早期诊断方法、结果敏感性的局限，及HCC细胞在发展过程中易发生侵袭转移等等多种复杂因素相关。所以，目前许多研究热点关注于在分子或基因水平上的肝癌早期诊断，及如何针对其侵袭、转移进行相应治疗。随着对HCC发生发展分子机制的深入研究，一类微小RNA（microRNAs，或miRNAs）被引入视线。miRNAs是参与基因转录后水平调控的非编码小RNAs，以干扰mRNA翻译的形式调控相关基因的表达。同时，已有的大量研究也证实了miRNAs与肿瘤的关系密切。其中，更有研究表明mir-34a与多种肿瘤的发生、发展是密切相关的。Notch信号通路广泛存在于多种生物体组织细胞中，是一种在进化过程中十分保守的信号转导系统，可调控并影响细胞分化、增殖、发育及凋亡等生物学行为。近几年的大量研究显示：notch1在多种肿瘤中异常表达，它与肿瘤的发生、发展过程也密切相关。有研究表明notch信号通路在HCC的发生、发展过程中也起到了重要的作用。已有部分研究结果发现在一些肿瘤中，mir-34a能够抑制notch1发挥抑癌作用。迄今为止，关于HCC中两者之间的关系国内、外暂时尚未见诸报道。本实验小组旨在通过对mir-34a与notch1在HCC组织、癌旁正常组织、正常肝组织、HCC细胞系与非肿瘤肝细胞中表达的差异和相互作用进行研究，探讨两者在HCC中的相互关系，为HCC侵袭、转移的研究和临床诊断、治疗及预后判断提供依据，奠定相应基础。目的：本实验拟通过观察mir-34a、notch1在HCC组织、癌旁正常组织、正常肝组织、不同侵袭能力肝脏肿瘤细胞系和非肿瘤肝脏细胞系中表达的差异及调控后的变化情况，研究并探讨二者与HCC临床病理特征的关系，及在HCC细胞侵袭、转移能力方面的作用及趋势。方法：应用实时荧光定量PCR法（qRT-PCR）和免疫组织化学染色法（SP法）检测mir-34a、notch1在132例HCC组织及癌旁组织、49例正常肝脏组织中的表达情况。应用统计学方法研究上述组织中mir-34a、notch1受体表达与HCC临床病理特征的关系。将分组后的患者进行Kaplan-Meier分析以比较各组的生存时间；将临床病理指标纳入多元逐步COX风险比例回归模型分析，观察mir-34a、notch1及其相关临床病理特征与HCC患者生存时间的关系。实时荧光定量PCR法检测不同侵袭能力的肝脏肿瘤细胞系（HepG2，Huh-7，SMCC-7721，MHCC97）和非肿瘤肝脏细胞系（HL-7702）中mir-34a的表达情况；Western Bloting方法检测细胞系中notch1的表达情况。通过特异性的microRNA mimics和microRNA inhibitors采用瞬时转染的方法分别作用于选定的肝脏肿瘤细胞系MHCC97-H、HepG2，以上调或抑制mir-34a的表达，采用Western Bloting方法检测2种肝脏肿瘤细胞系中notch1的表达变化情况。应用特异性的microRNA mimics瞬时转染肝脏肿瘤细胞系MHCC97-H以上调mir-34a的表达；microRNA inhibitors瞬时转染肝脏肿瘤细胞系HepG2以抑制mir-34a的表达，在体外采用transwell小室基质侵袭、迁移实验，观察这两种肝脏肿瘤细胞系侵袭、迁移能力的变化情况。结果：qRT-PCR检测显示132例HCC组织中mir-34a表达水平明显低于癌旁及正常肝脏组织，且转移灶癌组织比HCC组织低，差异有统计学意义（P＜0.05）。qRT-PCR检测显示132例HCC组织中notch1表达水平明显高于癌旁及正常肝脏组织，且转移灶癌组织比HCC组织高，差异有统计学意义（P＜0.05）。免疫组织化学染色显示notch1受体阳性染色主要位于细胞膜，呈现棕色及棕黄色颗粒样，细胞浆中亦有少量表达。在HCC组织中，26例（19.70%）阴性表达，34例（25.76%）弱阳性表达，37例（28.02%）中等阳性表达，35例（26.52%）强阳性表达。Notch1受体在HCC组织中表达明显高于癌旁组织及正常肝脏组织，表达水平差异具有统计学意义（P＜0.05）。在癌旁组织及正常肝组织中，notch1受体仅有少部分显示为弱阳性染色，其余为阴性。将north1评分值5分作为分界值将患者分成两组，分析发现mir-34a与north1在HCC及癌旁组织中均成负相关，相关系数分别为－0.259（P＝0.003）、－0.274（P＝0.002）。mir-34a、notch1在HCC组织中的表达均与患者的肿瘤恶性程度、肿瘤个数、肿瘤体积、淋巴结转移、TNM分期相关（P＜0.05）；而与患者的年龄、性别、肝功能、肿瘤部位、是否合并肝硬变、是否伴随肝炎病毒感染及AFP含量等因素无相关性（P＞0.05）。依据实验的设计目的和要求，选取表现典型的mir-34a低表达、notch1高表达组患者，及mir-34a高表达、notch1低表达组患者作为研究对象，进行Kaplan-Meier分析示：mir-34a低表达、notch1高表达组患者术后三年生存率（11.3%），明显低于mir-34a高表达、notch1低表达组（34.7%），差异具有统计学意义（χ2=38.163，P=0.011）。上述临床病理指标纳入多元逐步COX风险比例回归模型分析，结果表明：较大的肿瘤体积、多发的肿瘤、较低的肿瘤分化程度、出现远处转移、有静脉浸润、有门静脉癌栓、有卫星灶损害、较高的TNM分期、mir-34a低表达及notch1高表达是影响患者生存时间的独立危险因素；而本次实验采集的其他临床病理因素与患者生存时间无明显相关性。实时荧光定量PCR法检测不同侵袭能力的肝脏肿瘤细胞系后显示：4种肝脏肿瘤细胞系（HepG2，Huh-7，SMCC-7721，MHCC97）中mir-34a表达明显低于非肿瘤肝脏细胞系（HL-7702），其中MHCC97表达最低，HepG2表达最高，依据实验的最初设计目的和要求，选定该2种肝脏肿瘤细胞系为进一步研究对象，进而继续以Western Bloting方法检测此2种肝脏肿瘤细胞系中notch1的表达显著高于非肿瘤肝脏细胞系（HL-7702）。在选定的肝脏肿瘤细胞系MHCC97-H中瞬时转染特异性的microRNA mimics以上调mir-34a的表达后，应用Western Bloting方法检测此肿瘤细胞系中notch1的表达较调控前明显较弱；在选定的肝脏肿瘤细胞系HepG2中瞬时转染特异性的microRNA inhibitors以抑制mir-34a的表达后，应用Western Bloting检测显示细胞系中notch1的表达较调控前明显增强。应用特异性的microRNA mimics瞬时转染肝脏肿瘤细胞系MHCC97-H以上调mir-34a的表达，在体外应用transwell小室侵袭、迁移实验结果显示：该细胞系穿透小室膜的细胞数目明显减少。使用microRNA inhibitors瞬时转染肝脏肿瘤细胞系HepG2以抑制mir-34a的表达后，在体外应用transwell小室侵袭、迁移实验结果显示：该细胞系穿透小室膜的细胞数目明显增多。结论：mir-34a在HCC组织（或细胞）中较正常肝脏组织（或细胞）明显减低，notch1的表达明显增高；mir-34a通过负相关调节靶蛋白notchl参与并影响着HCC的恶性生物学行为；应用特异性的siRNAs上调或抑制肝脏肿瘤细胞系MHCC97-H和HepG2中的mir-34a表达，可以改变以上细胞系的侵袭、迁移能力；联合检测mir-34a及notch1在HCC中的表达及变化情况，对HCC的临床诊断、治疗及预后判断具有不可忽视的重要意义。