论文部分内容阅读
β-甘露聚糖酶(β-1,4-D-mannan mannohydrolase, EC 3.2.1.78),作为一种能水解葡甘露聚糖、甘露聚糖、半乳甘露聚糖以及半乳葡萄甘露聚糖主链β-1,4,-D甘露吡喃糖苷键的半纤维素酶类,其在微生物群体中含量十分丰富,是一种具有较为广泛应用前景的新型工业化用酶。目前由于该酶在微生物发酵产品中活力低下,使得发酵成本增高,造成了工业化酶制剂价格偏高而限制了其在多数工业领域的应用。为了降低相关生产成本,本研究前期对Pichia pastoris GS115/Ppic9K-β-MAN菌株(本实验室构建、保存)进行中试发酵优化,使酶活力满足工业化的生产要求,而后通过共表达透明颤菌血红蛋白、伴侣蛋白等手段,进一步降低发酵生产成本。首先,以表达β-甘露聚糖酶的毕赤酵母工程菌为研究对象,采用摇瓶发酵确定碳源、接种量、温度、pH等基础发酵条件；之后通过30L发酵罐进行高密度发酵,探究菌体浓度、DO值、甲醇浓度、甲醇补料方式等对目的蛋白产量的影响,并进一步通过验证不同因素之间的相互影响,来优化中试发酵工艺。本章优化得到30 L发酵罐中试工艺条件：接种量10%,葡萄糖质量浓度30 g/L,诱导温度28℃,pH5.0,DO值在10～20%之间。在此发酵工艺下,最终细胞浓度达到135g/L(DCW),目的蛋白表达量达到5.04 g/L,最高酶活力29600 U/mL,酶活力较初始值提高近24倍。其次,为了提高粗酶液的热稳定性,选取多种物质,通过单一实验探究其对粗酶液耐热稳定性的影响,而后通过四因素三水平正交相互实验优化β-甘露聚糖酶复合保护剂配方,加入优化的复合保护剂后,进一步研究该酶的耐热性质。结果表明,甘氨酸、山梨醇、甘油、甘露醇、氯化钙都能明显提高β-甘露聚糖酶的稳定性,复合保护剂配方为甘氨酸120 g/L、甘油600 g/L、甘露醇120g/L以及山梨醇25g/L,含有复合酶保护剂的β-甘露聚糖酶粗酶液在耐热方面有明显提高,且将粗酶液耐热性曲线的t1/2值提升了7.5℃,达到62.5℃,表明该复合保护剂配方对该酶的耐热性能有明显的提升作用。再次,为了改善高密度发酵生产过程中的溶氧限制,进一步提高酶表达量,本实验把经密码子优化的透明颤菌的血红蛋白基因(VHb)插入pPICZαA中,并整合到该β-甘露聚糖酶工程菌中,共同置于AOX1启动子调控之下,通过G418和Zeocin抗性筛选共表达VHb基因的表达β-甘露聚糖酶的重组酵母工程菌中。结果表明,在30L发酵罐水平上进行VHb菌株(VHb+)与原始菌株(VHb-)的发酵表达研究,在限氧条件下,VHb+菌株的酶蛋白表达量比对照菌株VH b-高90%,且透明颤菌血红蛋白提高了甲醇耐受性,缩短发酵周期约40 h,具有重要的工业应用价值。最后,分别设计二硫键异构酶(PDI)以及免疫球重链结合蛋白(Bip)的引物,以毕赤酵母基因组为模板通过PCR扩增目的基因片段,插入表达载体pPICZaA,分别整合到β-甘露聚糖酶工程菌中,筛选共表达二硫键异构酶的重组酵母(PM115)和共表达免疫球重链结合蛋白的重组酵母(BM115),在30 L发酵罐水平上分析两种共表达伴侣蛋白菌株与初始菌株对β-甘露聚糖酶表达的差异。结果表明,相同工艺下,PM115与原始菌株相比未有提高,而BM115发酵产酶能力高于原始菌株,最高酶活力达到40900 U/mL,最高总蛋白表达量13.22g/L,最高比酶活力达到3150 U/mg,分别比初始菌株提高38%、22%、18%,毕赤酵母基因工程菌GM115通过共表达伴侣蛋白Bip,提高了β-甘露聚糖酶的产量及比活力,为产品的工业化路线铺垫了基础。