二穗短柄草SnRK基因家族的鉴定及BdSnRK2.9功能研究

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干旱、极端温度、盐渍等非生物逆境胁迫严重影响植物生长发育,植物在长期的进化过程中逐渐形成了复杂的机制以抵御这些不良环境的影响。蛋白激酶作为细胞内信号转导的重要组成成分在逆境胁迫响应中发挥重要作用。蔗糖非酵解相关蛋白激酶(Sucrose non-fermenting1(SNF1)-related protein kinases,SnRKs)是一种重要的蛋白激酶家族,在动物、植物和酵母体内高度保守,并参与多种生物学过程。植物 SnRK家族广泛参与植物机体生长发育、物质代谢及各种逆境胁迫响应。虽然SnRK家族在水稻(Oryza sativaL.),拟南芥(Arabidopsis thalianaL.)基因组中已有鉴定和相关的研究工作,但二穗短柄草(Brachypodium distachyon L.)SnRK家族全基因组分析还未见报道。二穗短柄草是第一个完成测序的温带禾本科早熟禾亚科植物,与小麦(Triticum aestivumL.),大麦(Hordeum vulgareL.),高粱(Sorghum bicolor L.)有更近的亲缘关系。其具有基因组小、生长周期短及转化容易等优点,近年来已成为温带禾谷类物种的模式植物。本研究通过生物信息学手段在二穗短柄草全基因组水平鉴定了44个SnRK基因,在此基础上系统分析了SnRK基因家族的进化关系、表达特性、蛋白相互作用网络,并重点研究了 BdSnRK2.9在植物响应非生物逆境胁迫中的作用。  本研究主要内容包括:⑴通过BLAST及HMM算法,在二穗短柄草全基因组水平上鉴定出44个SnRK基因,其中3个基因属于SnRK1亚家族,10个SnRK2,31个SnRK3(CIPK)亚家族成员。对该家族基因结构与蛋白基序分析表明,每个分支成员都具有相对保守的基因结构和蛋白基序,说明分支成员具有更近的进化关系。染色体定位与共线性分析结果显示,72.7%的BdSnRK存在于共线性区段中,说明在二穗短柄草 SnRK扩张中片段复制事件起到重要作用。系统进化树分析显示,二穗短柄草与水稻有更近的亲缘关系,并且95%的SnRK家族成员在二穗短柄草与水稻中存在共线性关系,而仅有18%的该家族成员在二穗短柄草与拟南芥中存在共线性。这揭示了 SnRK基因家族确立于单双子叶植物分离前,并伴随植物进化过程通过片段复制快速扩张。⑵利用qRT-PCR分析了二穗短柄草BdSnRK2亚家族的表达特性,并对比了水稻SnRK家族基因表达芯片数据,结果表明,10个SnRK2亚家族成员广泛响应低温、高盐、渗透等非生物逆境胁迫以及ABA、乙烯、双氧水等信号分子刺激,不同基因成员响应模式不同,并与水稻同源基因存在一定的同质性。⑶利用拟南芥AtSnRK同源基因构建了 SnRK家族网络结构,相关基因功能富集揭示SnRK家族主要涉及蛋白催化过程,离子通道结合,DNA结合等功能,说明SnRK广泛参与代谢及抗逆信号传递等生物学过程。利用酵母双杂交技术验证了BdSnRK2亚家族蛋白相互作用网络,揭示了BdSnRK2s与PP2C,SCS,ABF等蛋白的相互作用关系,且该蛋白互作网络与双子叶模式植物拟南芥存在显著差异。⑷利用烟草(Nicotiana tabacumL.)遗传转化体系分析了BdSnRK2.9基因在逆境胁迫响应中的作用。过表达BdSnRK2.9基因的转基因烟草在150 mM甘露醇和100-200 mM NaCl的培养基上相比对照组有较为显著的根长,且转基因株系可显著提高干旱、高盐胁迫的耐受性。BdSnRK2.9可以与烟草 NtABF2互作,并共定位在细胞核中发挥作用。渗透和高盐胁迫下过表达转基因株系中NtABF2以及NtABF2下游抗性相关基因NtLEA5,NtMYB102,NtLTP1的表达上调。这些结果表明,BdSnRK2.9赋予转基因烟草对干旱和高盐胁迫的耐受性是通过激活烟草 NtABF2转录因子并启动下游相关抗逆基因表达实现的。
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