【摘 要】
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目的:（1）明确宫颈癌组织中RACK1的表达水平与肿瘤糖酵解及肿瘤微环境中淋巴管形成的相关性;（2）阐明RACK1影响宫颈癌糖酵解及淋巴结转移的分子机制;（3）阐明糖酵解在RACK1调控宫颈癌淋巴结转移中的功能和机制。方法:利用免疫组织化学技术检测宫颈癌及正常宫颈组织和宫颈癌细胞系中RACK1表达水平,分析其与临床病理参数之间的关系。sh RACK1慢病毒转染宫颈癌细胞,利用~1H-NMR检测上清
【基金项目】
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2017年高校科研计划（创新团队）项目；
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目的:（1）明确宫颈癌组织中RACK1的表达水平与肿瘤糖酵解及肿瘤微环境中淋巴管形成的相关性;（2）阐明RACK1影响宫颈癌糖酵解及淋巴结转移的分子机制;（3）阐明糖酵解在RACK1调控宫颈癌淋巴结转移中的功能和机制。方法:利用免疫组织化学技术检测宫颈癌及正常宫颈组织和宫颈癌细胞系中RACK1表达水平,分析其与临床病理参数之间的关系。sh RACK1慢病毒转染宫颈癌细胞,利用~1H-NMR检测上清代谢物的变化;根据代谢物变化确定与RACK1相关的代谢途径,葡萄糖测定试剂盒检测上清液葡萄糖含量变化,乳酸测定试剂盒检测上清中乳酸含量变化;q RT-PCR及Western blot技术检测关键蛋白的表达。Transwell实验检测干扰RACK1表达后宫颈癌细胞侵袭和迁移能力;成管实验检测淋巴管的形成;裸鼠足垫-淋巴结转移模型观察体内淋巴结转移情况。应用在线数据库预测RACK1可能结合的候选蛋白,免疫共沉淀、免疫荧光技术观察RACK1与候选蛋白的结合情况;通过生物信息学获得调控RACK1表达的候选转录因子,应用双荧光素酶报告基因、染色质免疫共沉淀验证两者的结合情况;KEGG数据库进一步预测下游信号通路,体外恢复实验观察通路活化情况。结果:（1）RACK1在宫颈癌组织中的表达高于宫颈炎组织,且RACK1高表达与肿瘤分化程度（P＜0.05）、淋巴结转（P＜0.05）有关。宫颈癌细胞系中RACK1表达高于正常宫颈上皮细胞（P＜0.001）,MS751和Si Ha细胞中达最高。两种细胞系中干扰RACK1的表达可以抑制细胞的侵袭（P＜0.001）和迁移能力（P＜0.001）;减弱淋巴管内皮细胞迁移（P＜0.001）和管腔形成能力。~1H-NMR检测发现RACK1表达变化导致糖酵解代谢紊乱（P＜0.01）,下调RACK1表达可以降低HK2、PKM2、GLUT1、LDHA（P＜0.001）4种糖酵解关键蛋白的表达导致葡萄糖摄取（P＜0.001）和乳酸生水平降低（P＜0.001）。（2）Hitpredict和Genemania在线数据库预测结果显示RACK1与IGF1R结合,且AKT/m TOR通路是其关键下游通路。免疫共沉淀和免疫荧光技术证明RACK1与IGF1R存在结合。利用IGF1作用于sh RACK1/Si Ha和sh RACK1/MS751细胞,证实两株宫颈癌细胞的AKT/m TOR通路蛋白被显著激活（P＜0.001）;4种糖酵解关键蛋白表达上升（P＜0.001）进而促进葡萄糖摄取（P＜0.001）和乳酸生成（P＜0.001）。在此基础上,添加Rapa后,可以明显抑制宫颈癌细胞中m TOR蛋白的活化（P＜0.001）;下调4种糖酵解关键蛋白表达（P＜0.001）导致葡萄糖摄取（P＜0.01）和乳酸生成水平降低（P＜0.01）。UCSC、HUMANTFDB和PROMO在线数据预测结果显示,POU2F2与RACK1启动子区存在结合,荧光素酶报告基因和染色质免疫共沉淀技术证实以上假设。在sh RACK1/Si Ha和sh RACK1/MS751细胞中瞬时转染POU2F2过表达质粒,OE POU2F2/sh RACK1组宫颈癌细胞中4种糖酵解关键蛋白表达上调（P＜0.001）导致葡萄糖摄取（P＜0.001）和乳酸生成（P＜0.001）增强。2-DG作用于OE POU2F2/sh RACK1组宫颈癌细胞后,细胞的乳酸生成能力（P＜0.001）减弱,而葡萄糖摄取能力未受影响（P＞0.05）。（3）IGF1作用于sh RACK1/Si Ha和sh RACK1/MS751细胞,细胞的侵袭和迁移能力提高（P＜0.001）;淋巴管内皮细胞迁移（P＜0.001）和管腔形成能力增强。在此基础上加入Rapa,宫颈癌细胞侵袭（P＜0.001）和迁移能力（P＜0.001）减弱;阻碍淋巴管内皮细胞迁移（P＜0.001）和管腔形成。在sh RACK1/Si Ha和sh RACK1/MS751细胞中瞬时转染POU2F2过表达质粒,OE POU2F2/sh RACK1组宫颈癌细胞中的侵袭和迁移能力（P＜0.001）提高;淋巴管内皮细胞迁移（P＜0.001）和管腔形成能力增强。2-DG作用于OE POU2F2/sh RACK1组宫颈癌细胞后,细胞的侵袭能力（P＜0.001）和迁移能力（P＜0.001）受到抑制;淋巴管内皮细胞迁移（P＜0.001）和管腔形成能力下降。结论:（1）宫颈癌组织中RACK1的高表达可增强糖酵解代谢,促进宫颈癌组织微环境中淋巴管的形成;（2）POU2F2调控RACK1促进下游IGF1R/AKT/m TOR信号通路的活化,进而引起糖酵解代谢增强。（3）微环境中乳酸蓄积可以促进淋巴管内皮细胞迁移与成管能力。
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