1研究背景芒果苷(Mangiferin)系纯天然化合物,具有广泛的生物活性,植物来源广,生产技术成熟,市售产品纯度高达95%以上。芒果苷至今仍未被开发为临床药物的原因之一是其药理作用泛而弱,定位不突出。有学者指出,芒果苷属于BCS-4类药物,溶解性和跨膜通透性均很弱,生物利用度低,从而制约了芒果苷药理作用的发挥。为了提高芒果苷的生物利用度从而提高其药理活性,大多研究从提高芒果苷的水溶性入手,但收效不明显；另有一些研究从提高芒果苷的跨膜通透性入手,这些研究全部集中在制备高脂溶性衍生物方面,虽有一些成效,但也不甚理想,所制备的衍生物至今均未得到开发应用。本论文也从提高芒果苷的跨膜通透性入手,制备高脂溶性的芒果苷酯化衍生物。目前尚未见到与芒果苷酯化衍生物有关的文献报道,本论文从这一空白点切入,预计会得到一些较有意义的研究结果。2方法与结果本论文的研究,涵盖化学合成、分离纯化、化合物结构确证、理化性质表征、药理学研究等内容。(1)化学合成。以芒果苷为起始化合物,以酸酐为溶剂,以H+为催化剂,使芒果苷分别与乙酸酐、丙酸酐和丁酸酐反应,生成芒果苷酯化衍生物。反应的选择性不强,反应产物中包含3-5个酯化程度不同的“多酯化衍生化合物”。(2)分离纯化和结构确证。采用硅胶柱层析方法从反应产物中分离得到7个新结构化合物(化合物Ⅰ-Ⅳ、PAM、HPM、HBM),依据1HNMR图谱、13C NMR图谱和HMBC图谱,全部确证其化学结构。其中3个产率最高的分别为：(1)7,2’,3’,4’,6’-五乙酯化芒果苷衍生物,或7,2’,3’,4’,6’-penta-acetyl-mangiferin (PAM),分子式：C29H28O16;(2)3,6,7,2’,3’,4’,6’-七丙酯化芒果苷衍生物,或3,6,7,2’,3’,4’,6’-hepta-propionyl-mangiferin (HPM),分子式：C40H46O18；(3)3,6,7,2’,3’,4’-六丁酯化芒果苷衍生物,或3,6,7,2’,3’,4’-hexa-butyryl-mangiferin (HBM),分子式：C43H54017。论文对这3个化合物进行了重点研究。(3)理化性质。PAM、HPM和HBM不溶于水而易溶于醋酸乙酯；在pH<9水中稳定,在碱水中有少部分分解；熔点明显降低,较芒果苷低近100℃；紫外吸收特征明显。(4)表观油/水分配系数。分别测定芒果苷、PAM、HPM和HBM在正辛醇和水组成的液—液互萃两相中的浓度,计算出油/水分配系数。芒果苷的油/水分配系数随pH值的减小而增大,但绝对数值较小(小于6)；PAM、HPM和HBM的油/水分配系数均大于100,最大值出现在pH7(均大于270),并随溶液酸度或碱度的增大而减小。(5)采用浓氨水致咳的小鼠模型研究止咳作用。与空白对照组比较,芒果苷高、中剂量组(1.0、0.5 mmol·kg-1)均有显著的止咳作用,可显著延长小鼠的咳嗽潜伏期(P<0.05),并能显著减少咳嗽次数(P<0.01)。PAM、HPM和HBM虽有一定的止咳作用趋势,引咳潜伏期也有所延长,但未显示出统计学显著性差异(P>0.05)；咳嗽次数也有所减少,但未显示出统计学显著性差异(P>0.05)。(6)采用小鼠气管排泌酚红模型研究化痰作用。与空白对照组比较,芒果苷高、中剂量组(1.0、0.5 mmol·kg-1)均能显著促进小鼠排泌酚红(P<0.05或P<0.01)；PAM、HPM和HBM虽然也有一定的促进排泌作用,但未显示出统计学显著性差异(P>0.05)。(7)采用组胺—胆碱联合引喘法研究平喘作用。与空白对照组比较,芒果苷高、中剂量组(1.0、0.5mmol·kg-1)组均能显著延长豚鼠的引喘潜伏期(P<0.05或P<0.01)；PAM、HPM和HBM虽然也显示出一定的延长作用趋势,但未显示出统计学显著性差异(P>0.05)。(8)采用体外细菌平皿培养法研究抑菌作用。PAM、HPM和HBM除在最大浓度(75 mg·mL-1)时对金黄色葡萄球菌敏感株(G+)和乙型副伤寒杆菌(G-)有抑制作用外,对其它菌株均未表现出抑制作用。(9)采用体外抗HSV-1研究抗单纯疱疹病毒作用。芒果苷、PAM、HPM和HBM均表现出一定的细胞毒性,但毒性很低；对疱疹病毒HSV-1的抑制作用不明显,CPE抑制率均不超过25%。(10)通过测定小鼠耳廓肿胀度及其腹腔毛细血管通透性来研究抗炎作用。与空白对照组比较,芒果苷高中剂量组(1.0.0.5mmol·kg-1)、PAM高中剂量组(0.25、0.125mmol·kg-1)、HPM高中低剂量组(0.25、0.125、0.063mmol·kg-1)和HBM高中低剂量组(0.25、0.125、0.063mmol·kg-1)均能显著抑制小鼠耳廓肿胀(P<0.05)；芒果苷低剂量组(0.25mmol·kg-1),PAM低剂量组(0.063mmol·kg-1)虽然有抑制肿胀的趋势,但未显示出统计学显著性差异(P>0.05)。腹腔通透性试验,芒果苷高中低剂量组(1.0、0.5、0.25mmol·kg-1)、PAM高中剂量组(0.25、0.125mmol·kg-1)、HPM高中低剂量组(0.25、0.125、0.063mmol·kg-1)和HBM高中剂量组(0.25、0.125mmol·kg-1)均能显著抑制毛细血管的通透性,减少腹腔液渗出,显示出显著的抗炎作用(P<0.01或P<0.05)；PAM低剂量组(0.063mmol·kg-1)和HBM低剂量组(0.063mmol·kg-1)也有抑制毛细血管通透性的作用趋势,但未显示出统计学显著性差异(P>0.05)。(11)采用MTT法和荷瘤动物研究抑制肿瘤作用。MTT法结果表明,PAM、HPM和HBM能使7901、hella和7404细胞株的活细胞数量减少,提示药物可促使肿瘤细胞死亡。与空白对照组比较,HBM高剂量组(1.0mmol·kg-1)对小鼠荷瘤(S180)有一定的抑制作用(P<0.05)；中剂量组(0.5mmol·kg-1)有一定的作用趋势,但未显示出统计学显著性差异(P>0.05)。(12)降血糖活性及降血糖作用机制研究。①采用链脲佐菌素所致糖尿病小鼠模型研究降血糖作用。与空白对照组比较,PAM高中剂量组(0.25,0.125mmol·kg-1), HPM高中剂量组(0.25,0.125mmol·kg-1)和HBM高中低剂量组(0.25,0.125,0.063mmol·kg-1)显示显著的降血糖作用(P<0.01)；芒果苷高中剂量组(1.0, 0.5mmol·kg-1), PAM低剂量组(0.063mmol·kg-1)和HPM低剂量组(0.063mmol·kg-1)显示一定的降血糖作用(P<0.05)；芒果苷低剂量组(0.25mmol·kg-1)有降血糖的作用趋势,但未显示出统计学显著性差异(P>0.05)。②采用肾上腺素所致高血糖小鼠模型研究对抗急剧血糖升高的作用。芒果苷高剂量组(1.0mmol·kg-1)、PAM高剂量组(1.0mmol·kg-1)、HPM高剂量组(1.0mmol·kg-1)和HBM高剂量组(1.0mmol·kg-1)均没有对抗肾上腺素的升血糖作用(P>0.05)。③在体外抑制蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)活性的试验中,在5μg·mL-1浓度时,PAM、HPM和HBM就显示出较高的PTP1B酶抑制作用；在20μg·mL-1浓度时,PTP1B酶产生明显沉淀,表明PAM、HPM和HBM具有极强的抑制作用。3结论(1)合成方法简单易行,可产生多种新化合物。采用酸酐直接酰化(酯化)法,很容易从芒果苷制备芒果苷酯化衍生物；采用常规的硅胶柱层析法可方便、较大量地分离和纯化芒果苷酯化衍生物,得到化合物单体。本文所得7个酯化衍生物均为新结构化合物,其结构为首次报道。(2)酯化衍生物PAM、HPM和HBM的为高脂溶性物质,其理化性质、油/水分配系数的数值大小和变化趋势完全不同于芒果苷；油／水分配系数远大于芒果苷的。(3)酯化衍生物的药理作用有明显改变。芒果苷在止咳、化痰、平喘、抑菌、抗病毒等方面有一定的活性,而酯化衍生物]PAM、HPM和HBM却没有,提示PAM、HPM和HBM因化学结构改变而丧失了这些药理活性。PAM、HPM和HBM在体外细胞培养中,能使7404、hella和7901细胞株的活细胞数量减少,提示其具有促进肿瘤细胞死亡的作用；HBM对荷瘤小鼠的肿瘤细胞(S180)也有较弱的抑制生长作用,这些作用与芒果苷相似,提示PAM、HPM和HBM保持了芒果苷的这一活性。PAM、HPM和HBM抗炎和降血糖作用的效价强度比芒果苷的高,只需1/4的摩尔剂量,即可产生与芒果苷相似的抗炎和降血糖效果,提示其抗炎和降血糖活性比芒果苷的高；此外,PAM、HPM和HBM能明显抑制蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B),提示PAM、HPM和HBM因化学结构改变而使抗炎和降血糖活性大大增强。(4)抗炎和降血糖作用显示一定的结构一效应关系。从芒果苷、PAM(乙酯化)、HPM(丙酯化)到HBM(丁酯化),酯化基团大小递增,脂溶性也递增,在相同剂量时,抗炎和降血糖作用强度呈递增变化。(5)酯化衍生物的降糖作用机制。芒果苷及其酯化衍生物PAM、HPM、HBM不具有胰岛素样作用,也不能刺激胰岛细胞在短时间内分泌大量胰岛素。PAM、HPM和HBM的降血糖作用机制可能是对PTPIB的抑制和促进受损胰岛细胞的恢复：一方面,通过抑制PTPIB,提高胰岛素受体浓度,从而提高胰岛素的利用率；另一方面,药物的高脂溶性使跨膜通透性增加,使更多药物进入胰岛细胞,使胰岛细胞得到更好地恢复,从而使胰岛细胞的分泌量增加。(6)化学结构对药理作用的影响大。从结构变化与药理活性变化的关系分析,芒果苷苷元上-OH基团的有无及数量,决定了止咳、化痰、平喘、抑菌、抗病毒活性的有无；而抗炎、抑制PTPIB活性和降血糖作用,只与芒果苷母核的化学结构和结构特点有关,与母核上链接的其它基团无关。(7)芒果苷苷元比芒果苷本身更具有研究开发价值。去除葡萄糖基后的芒果苷苷元,在相同剂量下其抗炎、降血糖作用可能更加显著；如进行酯化衍生,衍生物的抗炎、降血糖作用可能会得到飞跃式提升4创新点(1)用BCS药剂分类原则作为指导思想,对芒果苷进行结构修饰,提高其脂溶性,从而提高其跨膜通透性,增加其生物利用度,最终提高其药理活性；药理研究结果表明,抗炎和降血糖作用达到了预期的目的。(2)首次采用化学方法制备芒果苷酯化衍生物；所制备的7个酯化衍生物(化合物Ⅰ-Ⅳ、PAM、HPM、HBM)均具有新的化学结构,为首次报道。