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组织工程学是旨于修复、维持或改善受损组织功能的一门科学,其主要包括种子细胞、支架材料和细胞因子三个重要因素,其中以干细胞为基础的组织再生治疗正迅速进入临床应用。牙源性干细胞因其具有自我更新、增殖及多向分化的能力而受到关注。人根尖乳头干细胞（stem cells from the apical papilla,SCAP）来源于未发育完全的恒牙根尖组织,其具有增殖能力、迁移能力及多向分化潜能,是组织工程中种子细胞的优势候选者。Wnt5a是非经典Wnt信号通路中的代表性配体,Wnt5a缺失及其共受体受体酪氨酸激酶样的孤独受体 2（receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 2,ROR2）缺失的患者呈现Robinow综合征的特征,表现为轻中度小颌畸形、身材矮小及肢体短缩等多发的骨骼发育异常。PDZ结合基序的转录共激活因子（transcriptional co-activator with PDZ-binding motif,TAZ）是 Hippo 通路信号分子中的核心调控因子之一,其在牙乳头中表达丰富,且在釉结中高表达以控制牙齿发育的各个阶段。近年来,Wnt与Hippo信号通路间的相互作用解释了许多复杂的细胞调节功能。其中,Wnt5a/b-FZD/ROR-Gα12/13-Rho-Lats1/2-YAP/TAZ 信号轴已被证实参与成骨形成及细胞迁移。因而本研究推测Wnt5a与Hippo/TAZ在SCAP成骨形成过程中可能存在交互作用。目的:本研究选取SCAP作为种子细胞,旨在探讨Wnt5a如何调控SCAP成骨,并探索Wnt5a与Hippo/TAZ在SCAP成骨形成过程中的交互作用,为Wnt5a及根尖乳头干细胞在组织工程学中的应用提供理论依据。方法:（1）SCAP的分离、培养和鉴定:采用酶解法提取原代细胞,通过有限稀释法分离纯化细胞。流式细胞术检测细胞表面标志物;免疫荧光技术检测SCAP的特异性表面标志物CD24;成骨及成脂诱导检测多向分化能力。（2）Wnt5a/ROR2对SCAP成骨分化的调控研究:通过qRT-PCR及Western Blot分析检测不同浓度Wnt5a作用下SCAP中成骨相关因子mRNA及蛋白的表达情况。通过碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性及染色、茜素红染色实验检测Wnt5a作用下SCAP的ALP分泌水平、成骨诱导后矿化结节的形成情况,并进行钙沉积定量分析。采用免疫细胞荧光染色法验证SCAP中是否存在ROR2,小干扰RNA下调SCAP中ROR2表达,Western Blot检测Wnt5a/ROR2对SCAP成骨分化的作用。（3）过表达TAZ的SCAP模型构建及其在成骨分化中的作用:构建过表达TAZ的SCAP细胞模型,于成骨诱导3 d、7 d时利用qRT-PCR以及Western Blot检测过表达TAZ细胞模型对ALP、RUNX2的mRNA和蛋白表达影响,利用ALP染色及活性检测探究其对ALP分泌及活性的影响。于21 d时使用茜素红染色并进行钙定量检测评估矿化结节的形成情况。（4）Wnt5a与Hippo/TAZ交互作用对SCAP成骨调控机制的初探:使用 qRT-PCR、Western Blot 检测 Wnt5a 对过表达 TAZ 的 SCAP 中 ALP、RUNX2的mRNA及蛋白表达的影响。利用siROR2研究Wnt5a/ROR2作用下Wnt/β-catenin通路相关蛋白（GSK3β,p-GSK3β,β-catenin 和 TAZ）的表达情况。通过慢病毒感染构建过表达β-catenin的SCAP细胞模型,于成骨诱导7 d时使用 Western Blot 检测 Wnt5a 对过表达 β-catenin 的 SCAP 中 ALP、RUNX2 的影响,并通过ALP染色及活性检测、茜素红染色及钙定量实验检测ALP分泌水平、成骨诱导后钙沉积和矿化结节的形成情况。qRT-PCR及Western Blot检测TAZ的表达,验证 SCAP 中 Wnt5a/ROR2/GSK-3β/β-catenin/TAZ 通路的存在。结果:（1）SCAP的分离、培养和鉴定:通过酶消法获取根尖乳头细胞,有限稀释法获取SCAP,流式细胞术鉴定其为间充质来源,成骨、成脂诱导验证其具备多向分化潜能。免疫荧光检测发现SCAP的特异性标志物CD24高表达。（2）Wnt5a/ROR2对SCAP成骨分化的调控研究:Wnt5a（100 ng/mL）显著抑制 ALP、RUNX2 和 TAZ 的表达水平（P＜0.05）,降低ALP活性（P＜0.05）,抑制矿化结节形成（P＜0.05）。因而Wnt5a既抑制成骨又抑制TAZ的表达。免疫细胞荧光染色显示SCAP表面Wnt5a共受体ROR2呈阳性表达。利用ROR2 siRNA构建ROR2敲低模型。qRT-PCR和Western Blot检结果显示,siROR2#1的敲除效率最佳。与siCTRL组相比,siROR2组ALP、RUNX2 表达下调（P＜0.05）;与 siROR2 组相比,siROR2+Wnt5a 组 ALP、RUNX2蛋白表达下调（P＜0.05）,说明ROR2转运Wnt5a影响SCAP成骨。（3）过表达TAZ的SCAP模型构建及TAZ过表达对成骨分化的影响:通过荧光显微镜下观察、mRNA和蛋白表达水平评估慢病毒感染效率,结果显示OETAZ组TAZ表达较OENC组显著上调（P＜0.05）。成骨诱导3 d和7 d后,ALP染色显示OETAZ组强阳性,OETAZ组较OENC组ALP活性显著增强（P＜0.05）,ALP、RUNX2的表达增强（P＜0.05）。成骨诱导21d后,OETAZ组较OENC组矿化结节形成显著增多（P＜0.05）。因此,TAZ基因促进SCAP成骨。（4）Wnt5a与Hippo/TAZ交互作用对SCAP成骨调控机制的初探:利用Wnt5a刺激OENC和OETAZ模型7 d,ALP染色、ALP活性、qRT-PCR、Western Blot、茜素红染色及钙定量检测结果显示Wnt5a抑制TAZ介导的SCAP成骨。在此基础上,研究探究了经典Wnt通路在Wnt5a/TAZ介导的成骨分化中的作用。与 siROR2 组相比,siROR2+Wnt5a 组 β-catenin、p-GSK3β 和 TAZ 的表达较低,而总的GSK-3β在siROR2+Wnt5a组几乎没有变化。基于上述结果,可以得出结论:Wnt5a/ROR2通过经典Wnt通路抑制TAZ。使用慢病毒转染构建的过表达β-catenin的SCAP模型用于证实Wnt5a是否通过调节β-catenin抑制TAZ。通过荧光显微镜镜下观察、β-catenin mRNA和蛋白水平评估转染效率。OEβ-catenin组β-catenin mRNA和蛋白水平较OENC明显上调（P＜0.05）。利用Wnt5a刺激OENC和OEβ-catenin模型7 d,ALP染色、ALP活性、qRT-PCR、Western Blot、茜素红染色及钙定量检测结果显示Wnt5a通过下调β-catenin 抑制 TAZ 介导的成骨,可能存在 Wnt5a/ROR2/GSK-3β/β-catenin/TAZ通路调控SCAP的成骨。结论:（1）Wnt5a/ROR2可以显著抑制SCAP的成骨分化。（2）TAZ可以显著促进SCAP的成骨分化。（3）经典Wnt通路参与了 Wnt5a/ROR2/TAZ介导的成骨过程,表明Wnt5a/ROR2/GSK-3β/β-catenin/TAZ通路可能参与调控SCAP的成骨过程。