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研究目的1.构建大鼠脊髓损伤（SCI）动物模型并观察SCI后Pannexin-1（Panx-1）的表达变化;2.大鼠脊髓神经细胞原代培养、鉴定并构建大鼠脊髓神经细胞氧化应激损伤模型;3.构建慢病毒介导的过表达载体LV5-Panx-1和干扰载体sh-Panx-1并体外转染大鼠脊髓神经细胞;4.研究调控Panx-1的表达对大鼠脊髓神经细胞氧化应激损伤的作用;5.体外研究Panx-1加重大鼠SCI的机制。研究方法1.采用NYU Impactor-Ⅲ打击器构建大鼠SCI模型（Allen’s模型）,通过Basso Beattie Bresnahan（BBB）评分观察大鼠的后肢运动功能;实时荧光定量PCR（Real-time PCR）及蛋白免疫印迹法（Western Blot）检测Panx-1的表达情况。2.取孕15天SD大鼠胚胎,分离脊髓组织并采用改良的胰酶消化联合机械分离法进行脊髓神经细胞的原代培养;采用免疫荧光三标染色（Neu N/βtubulin-Ⅲ/Hoechst33258）鉴定脊髓神经细胞;采用双氧水（H2O2）干预构建大鼠脊髓神经细胞氧化应激损伤模型。3.构建慢病毒介导的Panx-1过表达载体（LV5-Panx-1）和干扰载体（sh-Panx-1）;有限稀释法检测慢病毒滴度;以上重组慢病毒分别感染大鼠脊髓神经细胞,观察荧光表达情况判定适宜的感染复数（MOI）;采用Western Blot检测转染后大鼠脊髓神经细胞Panx-1蛋白的表达变化。4.按不同处理因素将细胞分为:正常对照组（NC组）、单纯损伤组（Vehicle组）、空质粒转染组LV-con组（LV5-con组、sh-con组）、LV5-Panx-1转染组（LV5-Panx-1组）和sh-Panx-1转染组（sh-Panx-1组）;采用细胞增殖-毒性检测试剂盒（CCK-8）观察各组细胞活性;采用免疫荧光双标染色（βtubulin-Ⅲ/Hoechst33258）和流式细胞技术检测各组细胞凋亡情况。5.采用激光共聚焦显微镜检测以上各组细胞内Ca2+浓度;采用Real-time PCR和Western Blot技术测定各组细胞Bcl-2、Bax、Caspase-3、PARP-1的mRNA和Bcl-2、Bax、cleaved-Caspase-3、cleaved-PARP-1蛋白表达情况;探讨体外Panx-1加重大鼠脊髓神经细胞氧化应激损伤的作用机制。研究结果1.采用NYU Impactor-Ⅲ打击器成功建立大鼠SCI模型（Allen’s模型）,BBB评分显示大鼠SCI后评分逐渐回升,但损伤后2 d评分明显下降;Real-time PCR及Western Blot检测可见,与正常对照组、假手术组相比大鼠SCI后Panx-1的表达随时间延长明显增多,并在SCI后2 d达到峰值;且Panx-1蛋白表达与大鼠后肢运动功能BBB评分在SCI后1 d、2 d、3 d、5 d呈显著的负相关。2.取孕15天大鼠胚胎采用改良的胰酶消化联合机械分离法分离培养脊髓原代神经细胞,胎鼠脊髓较易剥离,神经细胞体外存活能力较强;保持全程低温操作,严格控制胰酶浓度及消化时间,轻柔吹打前加入适量DNA酶和MgCl2以防细胞聚集成团,采用无血清NPC培养基培养可有效提高脊髓原代神经细胞的纯度和产量,保持细胞良好的状态;免疫荧光染色可见特异的Neu N及βtubulin-Ⅲ染色,符合脊髓神经细胞的特征,经鉴定脊髓神经细胞纯度为90%;采用H2O2干预大鼠脊髓原代神经细胞建立大鼠脊髓神经细胞氧化应激损伤模型,CCK-8确定适宜的H2O2干预浓度为700μM,时间为3 h。3.成功构建LV5-Panx-1和sh-Panx-1并测定重组慢病毒滴度;将重组慢病毒分别感染大鼠脊髓神经细胞,观察荧光染色确定适宜的MOI均为50;采用Western Blot检测转染后Panx-1蛋白的表达证明转染后大鼠脊髓神经细胞能够持续高水平表达Panx-1蛋白或使其沉默。4.观察NC组、Vehicle组、LV-con组、LV5-Panx-1组和sh-Panx-1组细胞可见LV5-Panx-1组细胞肿胀、皱缩、漂浮、死亡较sh-Panx-1组明显增多,单纯损伤组、LV-con程度居中;CCK-8检测细胞活性可见sh-Panx-1组较LV-con组、Vehicle组、LV5-Panx-1组细胞活性明显增加;采用免疫荧光双标染色和流式细胞技术检测各组细胞凋亡可见在24 h、48 h、72 h LV5-Panx-1组较LV-con组、Vehicle组、NC组凋亡和死亡细胞均明显增多,而sh-Panx-1组较LV-con组、Vehicle组、NC组凋亡和死亡细胞均明显减少;采用激光共聚焦显微镜检测各组细胞内Ca2+情况可见在24 h、48 h、72 h LV5-Panx-1组较LV-con组、Vehicle组细胞内Ca2+浓度明显升高,而sh-Panx-1组较LV-con组、Vehicle组细胞内Ca2+浓度明显降低;采用Real-time PCR技术检测可见在24 h、48 h、72 h LV5-Panx-1组较Vehicle组、LV-con组表达Bax、Caspase-3明显增多,表达Bcl-2、PARP-1明显减少,而sh-Panx-1组较Vehicle组、LV-con组表达Bax、Caspase-3明显减少,表达Bcl-2、PARP-1明显增多;采用Western Blot技术检测可见在24 h、48 h、72 h LV5-Panx-1组较Vehicle组、LV-con组表达Bax、cleaved-Caspase-3、cleaved-PARP-1蛋白明显增多,表达Bcl-2蛋白明显减少,而sh-Panx-1组较NC组、Vehicle组、LV-con组表达Bax、cleaved-Caspase-3、cleaved-PARP-1蛋白明显减少,表达Bcl-2蛋白明显增多;以上指标在基因和蛋白表达水平变化基本一致,表达量随时间延长逐渐增高或降低,约48 h达到峰值或谷值。结论1.NYU Impactor-Ⅲ打击器建立大鼠SCI模型（Allen’s模型）可靠性高,稳定性好,可对大鼠进行可控性、可重复性、标准的脊髓撞击;大鼠SCI后Panx-1表达变化与BBB评分呈显著负相关。2.采用改良的胰酶消化联合机械分离法分离培养大鼠脊髓原代神经细胞,细胞产量高、活性好、纯度高达90%;采用H2O2构建大鼠脊髓神经细胞氧化应激损伤模型可靠性高,重复性好。3.成功构建慢病毒介导的LV5-Panx-1、sh-Panx-1,并将其成功转染大鼠脊髓神经细胞,实现其稳定高效表达。4.体外上调Panx-1表达可加重大鼠脊髓神经细胞氧化应激损伤,抑制细胞活性,促进脊髓神经细胞凋亡;而沉默Panx-1的表达可明显改善大鼠脊髓神经细胞氧化应激损伤,恢复细胞活性,抑制脊髓神经细胞凋亡。5.Panx-1作为膜半通道可能通过加快细胞外Ca2+内流、内质网Ca2+释放,导致细胞内Ca2+超载,引发内质网应激（ERS）,通过内质网途径促进脊髓神经细胞凋亡,从而加重SCI的继发性损伤。